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介紹結節病是一種multiorgan肉芽腫疾病引發,受基因-環境交互作用的影響。結節病影響45-300/100 000人在美國和死亡率逐漸增加。結節病病理學知識最大的差距是缺乏了解潛在的免疫機製推動進步的肺病。本研究的目的是定義lung-specific blood-specific縱向變化適應性免疫反應和他們的關係最近進步患者和非漸進式肺結果診斷結節病。
和分析方法支氣管鏡檢查在初始結節病診斷目標縱向端點研究是一個總部位於美國,nih資助的專門縱向血液和支氣管鏡檢查研究。報名將出現在四個中心目標樣本容量為80合格的參與者在18個月內組織診斷。參與者將接受六個研究訪問超過18個月。除了連續測量肺功能、症狀調查和胸部x射線,參與者將進行收集的血液和兩個支氣管鏡檢查和支氣管肺泡灌洗相隔6個月。剛處理樣品染色和flow-sorted隔離的CD4 + T輔助(Th1、Th17.0和Th17.1)和T調節細胞免疫的人群,其次是下一代RNA序列。我們將構建生物信息學工具使用此基因表達定義與結節病endotypes進步和非漸進式肺病結果和驗證工具使用一個獨立的群體。
道德和傳播研究協議已通過國家猶太醫院的機構審查委員會(IRB # hs - 3118),愛荷華大學(IRB # 201801750),約翰·霍普金斯大學(IRB # 00149513)和加州大學舊金山(IRB # 17 - 23432)。所有的參與者將被要求提供書麵知情同意。結果將通過出版物、雜誌傳播科學會議、病人倡導組織在線內容和社會媒體平台。
- 免疫學
- 間質性肺病
- 呼吸係統藥物(見胸醫學)
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本研究的優點和局限性
這是最大和最地理環境的不同搭配的縱向支氣管鏡檢查研究血液分析表現在肺結節病在美國迄今。
研究設計將使用重複措施的綜合臨床表現型策略在18個月確定最近診斷出疾病,患者的肺的結果將是一個豐富的臨床和生物數據資源研究肺結節病。
實驗設計將利用單細胞分析定義immunophenotypic疾病相關的CD4 T細胞的數量隨著時間的變化,並將結果與進步和非漸進式肺結節病的臨床表型。
實驗計劃還將測量轉錄資料孤立的CD4 T細胞數量使用RNA序列,使施工計算預測工具通過小說表達的反褶積和協會的發現與進步,非漸進式肺結節病。
潛在的方法論的限製是依賴流血細胞計數器在每個加工中心的新孤立樣本需要顯著的優化。
介紹
結節病是一種多係統肉芽腫性疾病,被認為是引發和受基因-環境交互作用的影響。1這種情況會影響至少45-300/100 000人在美國2和死亡率上升。3肺結節病影響超過90%的情況下。最大的差距在結節病的知識管理是一個缺乏工具來辨別哪些科目將會發展進步的疾病與穩定或彙款。此外,先進的療法是有效的缺乏與缺乏理解病理生理學推動進步的疾病。4雖然環境誘因不明,5 - 8激活的炎症反應的特點是一個優勢的CD4 + T細胞,細胞因子的生產、巨噬細胞激活和肉芽腫形成。9到18
臨床結果在結節病的免疫學因素仍知之甚少。結節病是傳統上的特點是提高生產的移行(IFNγ)CD4 + T細胞。重要的是,最近的小說《他鄉發現大多數IFNγ-producing細胞在支氣管肺泡灌洗(BAL)結節病病人熊Th17表型和更正確地歸類為Th17.1細胞而不是Th1細胞。19此外,一個健壯的擴張IFNγ-producing Th17.1細胞還確定了一個歐洲的新診斷結節病病人,和一個更引人注目的擴張白介素17-producing Th17細胞在外周血。20.小鼠模型揭示了功能性“可塑性”Th17細胞,展示他們的“transdifferentiate”抗炎能力表型定義的轉錄概況和監管能力。21其他研究支持,赤字調節性T細胞(Treg)能力可能允許在結節病疾病活動。22日至25日換句話說,在結節病可能取決於疾病活動,在一定程度上,對T細胞功能的可塑性,造成Th17細胞分化轉化成致病性Th17.1細胞和抗炎亞群,如體內所示。21因此,我們的研究的假設指出Th17.1和亞群扮演重要然而對立的角色來決定在結節病的臨床結果,,Th17細胞轉錄可能反映了一個多功能的角色(如Treg)剖麵穩定患者疾病(非漸進式或改善)。
支氣管鏡檢查在初始結節病診斷目標縱向端點(閃亮)的研究是一個NIH(美國國立衛生研究所)主辦,多中心,縱向研究,將測量免疫反應的變化及其與肺結節病病人結果的關係早在他們的疾病。這是第一個研究調查縱向成對血液和BAL T細胞表型的變化。這項研究有三個主要目標。在目標1,我們將測量T細胞譜係多樣性的變化(Th17.1, Th17 Th1和Treg)發生縱向隨著結節病學科的發展進步或非漸進式的疾病。在目標2中,我們將定義T細胞譜係的改變在疾病過程中通過識別基因組轉錄概況的純化Th17.1, Th17, Th1和Treg細胞使用低投入RNA-sequencing (RNA-seq)。在目標3中,我們將構建計算工具從T細胞譜係多樣性和基因表達數據定義和/或結節病endotypes使用生物信息學預測反褶積和biostatistical方法。我們將延長美國國立衛生研究院的基因組發現畢業生研究(alpha -基因組研究十分缺乏和結節病)26通過比較我們的基因組T細胞與基因表達數據簽名從這群獨立預測T細胞譜係和關聯研究結果定義用於這項研究。這些生物信息學工具也可以應用於其他基因組數據集從美國和歐洲軍團。
本研究填補了主要差距在我們當前的知識通過專注於肺結果的縱向關係的措施與T細胞表型cell-sorting血統使用一個集成的方法,其次是RNA轉錄剖析,除了測量血液中的T細胞表型和BAL隔間。這一研究獲得的基因表達數據將deconvoluted創建一個管道的計算工具,可以應用於其他數據集來預測疾病表型與臨床課程。這些工具也可以用來評估新興免疫調節治療的臨床反應和識別細胞信號通路,可以有針對性的與現有的小分子抑製劑或生物療法。
和分析方法
研究背景
這項研究涉及到四個學術大學建立在結節病護理和臨床中心研究:國家猶太衛生(NJH),愛荷華大學,加州大學舊金山分校(UCSF)和約翰霍普金斯大學。所有中心代表地理範圍從東海岸到西海岸。每個站點負責招收同樣數量的參與者(圖1)。
Organisationalstructure多點的研究。參與者將在四個臨床中心登記,愛荷華大學(UI),加州大學舊金山分校,國家健康猶太人(NJH)和約翰·霍普金斯大學(JHU)。這些中心負責biospecimens臨床數據的收集和處理。流cytometric-sorted CD4 T細胞的數量會被運送到基因組學工具在國家衛生猶太RNA隔離和下一代測序。
合格標準
參與者將在18個月內被診斷的招生標準支持由美國胸科學會。27提出了附加入學資格標準箱1。參與者與纖維化(x射線胸透,CXR四期)肺疾病將排除這種形式的肺部疾病被認為是長期存在的。
包含和排除標準
入選標準
組織病理學診斷結節病根據美國胸科學會/歐洲呼吸學會結節病聲明除了洛夫格倫綜合征免除病理診斷。
結節病的診斷在18個月內報名。
不吸煙者(< 10久和禁止吸煙前6個月入學)包括vap和使用大麻。
沒有係統性的免疫抑製的2周內招生的曆史。
胸部x光片竹莢魚階段0,I, II, III (x射線胸透階段0需要肺活檢證實肉芽腫炎症)。
排除標準
無法容忍研究程序由網站首席研究員。
懷孕。
主動吸煙者。
係統性免疫抑製治療2周內招生除了吸入類固醇。
竹莢魚四期。
活躍的證據心髒、神經或眼科與結節病,需要係統性的免疫抑製治療。
鈹敏化作用和/或診斷疾病,常見的變量免疫缺陷,分枝杆菌和/或真菌感染或疑似過敏性肺炎。
在除了阿司匹林抗凝。
活躍的細菌或病毒感染,用抗生素或免疫後4周內報名(5月評估參與四周後段)。
已知的醫學問題,可能會影響生物的解釋,包括惡性腫瘤、自身免疫、哮喘和慢性阻塞性肺病(慢性阻塞性肺病),慢性病毒感染(乙肝、丙肝,皰疹病毒需要抑製的藥物,HIV(人類免疫缺陷病毒)。
除了可能治愈癌症的曆史non-metastatic皮膚癌。
目前製度化(如監獄、長期護理設施)。
其他共病情況,增加支氣管鏡檢查並發症的風險包括不受控製的高血壓和/或糖尿病、不穩定的冠狀動脈疾病或失代償性心力衰竭,心律失常。
研究過程
研究參與者將經曆幾個過程中所描繪的一樣表1。曆史和物理考試將在每一個研究去評估疾病狀態和變化的測量和確認的安全與灌洗進行支氣管鏡檢查。前後CXR和肺功能測試包括用力肺活量(FVC)、用力呼氣量在1 s (FEV1)和一個氣息擴散能力一氧化碳(DLCO)將基線和隨訪期間每隔6個月。標準的支氣管鏡檢查與清洗將基線和6個月後。每6個月研究訪問,參與者將完成抽血和三個patient-reported結果數值量化措施呼吸困難(加州大學聖地亞哥氣短問卷28)、生活質量(12項短形式的調查(SF-12)29日)和疲勞(patient-reported結果測量信息係統30.)。
結果
研究的主要結果在完成訪問將進步的肺結節病。定義這個結果,我們將使用一個複合測量肺功能和放射學測量。肺功能、肺功能下降,我們將定義進程使用的閾值,在間質性肺病文獻的先例。31日32特別的,參與者會進步的肺部疾病的定義是否有下降≥10% FVC和/或殘或DLCO下降≥15%。胸部成像,我們將定義進程通過增加混濁胸片上由解釋放射科醫師/調查員。如果一個參與者符合肺功能定義或CXR定義,他們將被歸類為進步的肺部疾病。參與者不符合這些定義將被歸類為非漸進式的疾病。我們會排除其他原因可能模仿進步疾病臨床表現的基礎上,射線照相模式符合結節病和BAL細胞計數和差異分析。拜爾港文化將根據臨床適應症。
參與者的時間表
研究訪問和時間表中描述圖2。程序在每個訪問中概述表1。每隔6個月報名(V1)和(V3, V5, V6),參與者將評估肺功能的程序,在18個月的隨訪期間CXR和調查問卷。V2和V4訪問關注biospecimen收集與灌洗和靜脈穿刺支氣管鏡檢查和將發生在1月的V1和V3,分別為(圖2)。第二次支氣管鏡檢查會發生大約5 - 6個月後第一次支氣管鏡檢查。參與者也將進行靜脈穿刺采血在版本5和版本6。
研究設計與時間表。參與者將評估肺功能的程序,CXR和問卷報名(參觀1或V1)和每隔6個月(V3, V5, V6) 18 -月隨訪期間。V2和V4訪問由biospecimen收集與灌洗和靜脈穿刺支氣管鏡檢查和將發生在1月的V1和V3,分別。第二次支氣管鏡檢查會發生大約5 - 6個月後第一次支氣管鏡檢查。參與者也將進行靜脈穿刺采血在版本5和版本6。CXR,胸部x光片。
樣本大小
我們的主要結果是確定輔助T細胞的分布和Treg細胞在血液和BAL樣本配對時間和將這些測量與臨床結果(進步vs非漸進式疾病)。從我們小組基於之前的隊列研究,33大約有50%的結節病病人遇到疾病進展的定義。因此,我們認為50%的招生目標樣本(即40參與者的目標招生80名參與者)將會進步。α= 0.00625(0.05/8四子集,兩個時間點),我們將> 80%功率檢測0.82 SD不同組之間細胞百分比子集;如果隻有40%的進步,我們將> 80%功率檢測0.85 SD組之間的區別。基因表達分析,我們將會有80%的力量來檢測0.95 SD改變進步和非漸進式參與者之間的表達式或R20.19之間的表達和定量等臨床表型FVC,假定α= 0.001。
數據收集方法
鑒定臨床數據將輸入並存儲在一個中央搬運工(研究電子數據捕獲)數據庫(https://www.project-redcap.org閃亮的創建研究和加州大學舊金山分校主辦。數據工具包括人口統計信息、機關參與使用修改後的機關評估工具,34病史、藥物、問卷反應,肺功能測量、全血細胞計數、細節與biospecimen血液和BAL的集合。機關評估工具是由德爾福研究方法34和是一種廣泛接受調查,量化器官參與結節病。26將完成調查問卷參與者在紙上或通過一個搬運工調查。呼吸困難和疲勞問卷是間質性肺病患者進行驗證28 35 36結節病,30 37分別。SF-12儀器是一個廣泛使用的生活質量評估工具,得分為精神組件總結總結分數分數和一個物理組件。29日支氣管鏡檢查與清洗將在兩個子分段進行使用480毫升無菌生理鹽水。Prebronchoscopy和postbronchoscopy評估和監控將按每個機構的標準治療。每個中心將遵循推薦ATS /人指南測試肺量測定法的性能38和DLCO。39
Biospecimen集合
一個完整的血細胞計數將在訪問收集2,4,5,6 (圖2)。血清將收集訪問2、4、6。PMBC將收集訪問2和4流儀和基因表達分析和處理。PBMC(外周血單核細胞)也將被收集在5和6和冷凍。過剩PBMCs訪問2和4也將被凍結。全血將收集到DNA PAXgene管和凍結在訪問5並將收集和凍成RNA PAXgene管在訪問2和6。所有冷凍樣品將被存儲為將來使用IRB審批中指定在每個站點。細胞分離PBMC和BAL樣本將進行多參數流式細胞術Treg排序,Th1、Th17.0 Th17.1人群。有序的細胞將與適當的核糖核酸酶滅活緩衝區和細胞溶解一直凍結在−80°C,直到處理。瓶細胞溶解細胞將運往NJH RNA隔離和RNA-seq下一代測序每個排序的人口。
數據管理
數據分析師將執行數據驗證依照study-wide協議規範。季度數據檢查計劃將在進入運行識別差異數據。研究地點將通報數據差異和查詢解析將和數據庫進行更新。標記的差異將包括數據不一致、缺失的數據範圍檢查和偏離協議。將會有一個最後的數據驗證檢查study-wide數據集和數據庫將被鎖定後所有人員的批準。
統計分析
我們的主要結果將是確定輔助T細胞的分布和Treg細胞在配對的診斷和隨訪血液和BAL樣品和將這些測量與臨床病程(進步vs非漸進式疾病)。主要統計分析將使用t或秩和測試,是適當的,比較每個子集的百分比(如Th17.1)參與者之間與進步和非漸進式的疾病。主要分析將使用招生分布預測進步vs非漸進式疾病在隨訪;二次分析將考慮的變化頻率之間招生和後續的一個子集。探索性分析之間的協會將測試細胞百分比和疾病嚴重程度指標子集(FEV1、FEV1 / FVC、DLCO)。
表達與臨床結果之間的聯係:確定單個基因或基因組合與臨床結果相關聯,一係列的分析將從平衡計算使用基因表達和PBMC樣本。目標1中定義的主要臨床結果(進步vs非漸進式)。利用推斷的能力超過橫斷麵的相關性,主要分析將在招生預測的主要測試基因表達是否在後續的臨床結果。二次分析將測試是否重要基因表達變化之間的入學率和後續確認以上相關的臨床結果在隨訪。主要推理關於疾病病因學將基於基因表達從BAL樣本在所有結節病病例。識別潛在的基因表達標記的主要結果,PBMC將被用來識別基因的表達的基因表達與落下帷幕,預測臨床結果。探索性分析將考慮其他時間點組合和單獨使用PBMC基因表達來預測臨床結果。
兩個團體之間的微分表達式(例如,進步vs非漸進式):這將是發現通過使用軟件DESeq2負二項回歸,40調整了年齡和性別。我們還將使用CIBERSORTx deconvolve RNA-seq數據來預測程控比例41(我們可以驗證流分析結果)和細胞類型的細胞類型特異的基因表達來計算我們可以可靠地分開。連續的結果之間的聯係(如FVC)和閱讀數將通過回歸模型檢驗與臨床結果作為獨立變量和閱讀數預測,也調整了年齡和性別。我們將執行這些測試使用讀計數所有的基因在招生主要分析;二次分析將使用的正常閱讀數量從招生到後續變化隻有那些之間的基因差異表達的整體招生和隨訪。進步與非漸進式疾病微分表達式分析之後,我們將使用顯著相關基因進行層次聚類來確定基因的結合的能力區分進步和非漸進式的病例。我們將進行類似的分析如上所述的識別途徑參與和重疊基因顯著相關的臨床結果測量在這個研究。
目標3,已知與預測相一致程控細胞類型特異的表達值比例或將由皮爾森相關係數和均方根誤差來衡量線性,估計偏差,分別。42實證p值生成測試簽名的零假設,沒有細胞類型矩陣出現在一個給定的混合應用蒙特卡羅隨機抽樣策略的混合樣品。42類似的策略將被用來估計p細胞類型特異的表達數據的值。
臨床結果:類似於目標2,我們將首先測試是否在特定的基因或基因表達與臨床結果相關聯的基因的組合。在這一目標,我們將能夠使用細胞類型特異的表達的數據來測試這些關聯。我們將使用同樣的方法而言,主要分析在礦山(表達式招生預測臨床結果在隨訪)和二次分析(BAL表達式之間的變化在後續課程和後續預測臨床結果)。我們預計選擇一個或兩個特異性表達譜子集而不是測試所有子集;我們將使用來自目標2和目標3的結果確定最有可能出現的細胞類型駕駛任何臨床關聯。探索性分析將評估所有細胞和PBMC表達子集。我們將首先測試單個基因在每個子集也考慮使用主成分分析降低維數除了其他細化列表的基因測試基於我們的結果目標2。如果我們測試所有的基因,我們將使用一個錯誤發現率≤0.001,類似於目標2。如果我們有一個更小的子集的基因在主要分析測試,我們將使用Bonferroni調整來確定我錯誤率的類型。閃亮的構造計算工具和確定endotypes研究隊列將與一個獨立的測試樣本(即畢業生數據集)。
研究時間表
招聘於2020年2月開始,預計完成2023年2月訪問學習。
病人和公眾參與
不適當的或可能的患者或公眾參與設計,或行為,或報告,或傳播我們的研究計劃。
道德和傳播
這項多中心研究進行按照全球接受良好實踐的標準,符合赫爾辛基宣言和地方性法規。研究協議已通過國家猶太醫院的機構審查委員會(IRB # hs - 3118),愛荷華大學(IRB # 201801750),約翰·霍普金斯大學(IRB # 00149513),加州大學,舊金山(IRB # 17 - 23432)。所有的參與者將被要求提供書麵知情同意。所有手稿的研究將提交的同行評議期刊。結果將通過出版物、雜誌傳播科學會議、病人倡導組織在線內容和社會媒體平台。
倫理語句
病人同意出版
確認
這項工作沒有以前或發表會議召開的一次會議上提出的抽象。我們願意承認Kristyn MacPhail為她貢獻研究設計。
引用
腳注
貢獻者所有作者貢獻的概念和設計研究。起草這份手稿是由NYH LLK。嚴格的批評提供了LDH、EKW NKA, LP BRW, REM, PG, BQB,噢,MG,秒,JC, ESC, LAM SML和BPO 'C。
資金這項研究是由美國國家心髒,肺和血液研究所(NHLBI)國家衛生研究所(NIH),授予5 r01hl136681數量。
相互競爭的利益作者聲明,這項研究是在沒有進行任何商業或財務關係可能被視為一個潛在的利益衝突。
病人和公眾參與病人和/或公眾沒有參與設計,或行為,或報告,或傳播本研究計劃。
出處和同行評議不是委托;同行評議的倫理和資金審批之前提交。