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摘要
簡介缺血性中風是導致成人殘疾的主要原因。因此，一種基於有效抗血小板治療的策略被開發出來。目前對抗血小板治療的監測僅限於高危、預後不良的患者。事實上，利用現有的血小板功能測定對抗血小板治療進行生物學監測並不能提供一種全局的綜合方法。血小板透射電鏡是一種可靠的血小板形態結構分析工具，最近被證實可用於評估不同的超微結構異常，可用於收集血小板的所有超微結構特征和評估血小板的活化程度。
和分析方法我們的前瞻性和描述性試點研究將包括50名連續因缺血性卒中住院的患者。我們希望識別與血小板活化程度相關的超微結構特征，以指導臨床醫生製定抗血小板治療策略。
道德和傳播法國倫理委員會(comité de protection des personnes d 'Ile-de-France VII)批準了將發給參與者的信息通知和本次試驗的協議(協議編號21-031)。
這項試驗的結果將通過科學出版物傳播。
試驗注冊號碼NCT05004233．
- 中風藥物
- 血管醫學
- 中風
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本研究的優勢與局限性
這是一項試點和描述性研究，研究對象為連續住院的非心栓性缺血性卒中或短暫性缺血性發作的患者。
這項轉化研究是基於一名患者在服用抗血小板藥物前後的血小板超微結構分析。
這項初步研究是評估抗血小板藥物不良生物反應的第一步。
背景
在法國，缺血性中風是導致成人殘疾的主要原因，是導致癡呆的第二大原因，也是導致過早死亡的第二大原因。因此，需要建立治療策略，以防止血小板活化的急性階段的疾病。1 - 3
腦卒中二級預防的推薦治療策略是基於疾病的生理病理。心髒栓塞性腦卒中推薦使用抗凝藥物，而抗血小板治療則用於急性缺血性腦卒中的治療。
自2014年以來，指南推薦阿司匹林單藥治療(50-325 mg /天)或聯合雙嘧達莫(2200 mg膠囊，每天兩次)。4
氯吡格雷(75 mg)也是缺血性腦卒中推薦的二級預防策略。
缺血性腦卒中最常見的生理病理機製是血小板活化導致血小板聚集並形成動脈閉塞性血栓。1 - 3
其生理機製包括循環血小板最初粘附於改變的血管壁、血小板的超微結構激活、活化放大、α2β3血小板受體構象改變、纖維蛋白原連接和血小板聚集等。5
在卒中急性期，血小板活化與特定的超微結構模式有關:血小板形狀為球形，血小板延伸不同類型的細胞突起，發生顆粒集中，顆粒在開放的小管係統中釋放其內容物。最後，血小板聚集發生。6 7抗血小板藥物抑製血小板活化和血小板聚集。
抗血小板治療監測是基於體外試驗(光透射聚集試驗，流式細胞術測定血小板內磷vasp或膜P選擇素表達和Verifynow)。利用激動劑(花生四烯酸，ADP)體外複製血小板活化。
高水平的氯吡格雷生物低反應的報告取決於測定和選擇的臨界值來區分氯吡格雷低生物反應。8研究表明，在良好的治療過程中，對一種抗血小板藥物的低生物反應與心血管結局的增加相關。9日10大多數研究都是基於一小群患者，通常缺乏方法、技術和後勤方麵的標準化。
最近，一項大型試驗評估了抗血小板生物監測的有效性和臨床效益，該試驗采用雙隨機化方法評估了藥物洗脫支架植入的常規抗血小板策略與監測指導策略，以及支架植入一年後中斷治療與繼續治療(ARCTIC)和定製抗血小板治療與推薦劑量普拉格雷(ANTARCTIC)。11日12不幸的是，這項研究並沒有顯示對患者有任何好處。這種缺乏益處的原因是這些檢測的低預測價值，缺乏對非心栓性缺血性卒中的驗證臨界值，從而可以判斷氯吡格雷的生物反應較差。
抗血小板監測試驗已在大規模心血管試驗中得到研究。目前歐洲心髒病學會的穩定angor治療指南不推薦在選擇性血管成形術前後進行每日抗血小板監測。這一III類建議得到了a級證據的支持。不再推薦每日使用基於生物測定的抗血小板治療監測。13 - 15但是一組歐洲專家的立場聲明16對高風險和預後差的患者，支持抗血小板監測試驗。
缺血性卒中患者氯吡格雷生物反應評價(AAPIX)研究的主要思想(臨床試驗。gov標識NCT01955642)的研究目的是在符合監管建議的情況下，使用光透射聚集法(LTA)和VASP測定法(VASP)來監測在聖艾蒂安醫院神經血管科住院的非心源性缺血性卒中患者的抗血小板治療。72例患者被納入臨床試驗。17日至19日高水平的氯吡格雷低反應者報告了LTA和VASP分析。我們發現測定值之間缺乏相關性。此外，新臨床結果的低複發表明，我們研究中用於區分氯吡格雷低反應性缺血性卒中患者的心血管患者血小板反應性指數(PRI)的臨界值為50%並不理想。因此，對缺血性腦卒中患者需要一個可靠的、特定的臨界值。為此，必須建立大規模的多中心試驗。
另一個選擇是開發一種新的形態測量和綜合技術，不需要任何激動劑誘導體外激活過程，如目前的抗血小板監測分析。
電子顯微鏡已廣泛用於血小板的研究20.特別是用於血小板活化程度的超微結構評估。21日22血小板透射電鏡能綜合反映缺血性腦卒中患者抗血小板治療的有效性，並能綜合處方中所使用的抗血小板藥物和所涉及的激動劑。
本項目的第一部分是在收集血小板超微結構特征的基礎上進行描述性初步研究。
通過透射電鏡圖像(圖1)．血小板的超微結構特征是基於血小板質膜和血小板組分的描述，如開放的管狀係統、密集的管狀係統、血小板超薄切片的赤道麵存在外周微管環、肌動蛋白網絡組織和一堆細胞器的組織:線粒體、溶酶體、α和致密顆粒。6 7 23特異性的超微結構特征可以提供血小板靜息狀態或特異性、精確的活化程度的信息。
審判大綱。透射電子顯微鏡。
缺血性腦卒中患者的血小板特征存在明顯的異質性，血小板在腦卒中後恢複階段並非均勻激活。24
一種有效的抗血小板治療的開始可能會誘導血小板抑製。我們將收集與此抑製相關的超微結構特征。無效的抗血小板治療可能不會誘導血小板抑製和血小板抑製的超微結構模式。
我們初步研究的目的是描述非心源性卒中住院患者在使用抗血小板藥物後發生的血小板超微結構變化。
透射電鏡是評估遺傳性血小板超微結構缺陷的一種參考技術。Chen和合作者已經標準化和驗證了超薄切片血小板電子透射顯微鏡(MET-PC)。他們確定了靜止的血小板具有細長和盤狀的特征超微結構。糖原、α顆粒和管網分布規律。25這種MET-PC技術得到了驗證25一個北美專家小組這種可靠的方法將用於我們的描述性試點項目。
應用Neumüller對血小板超微結構進行了分析et al。為提高健康誌願者血庫血小板濃縮物的監測質量。26血小板超微結構標準的列表已經建立:
圓形或盤狀血小板形態，有突起。
α或致密顆粒觀察。
線粒體、糖原均勻或不規則分布，密集的管狀係統。
擴張開管係，脫粒期。
超薄血小板赤道麵外周或中央微管環。
血小板聚集。
我們希望利用這一超微結構特征列表來評估非心源性卒中患者抗血小板治療開始前後的血小板活化程度。這對於監測非心栓性缺血性腦卒中的抗血小板治療是有用的。
方法
研究人群
這是一個試點和描述性研究。將前瞻性招募在聖艾蒂安大學醫院急診部因非心栓性缺血性中風或短暫性缺血性發作(TIA)住院的連續患者。計劃在2022年至2024年期間納入。
符合條件的標準為:有社會保障關係，簽署知情同意書，患者年齡≥18歲，住院治療非心栓性缺血性卒中，需要根據常用指南(箱1)．
電中風研究的納入和排除標準
入選標準
成年患者>18歲
急診科住院的病人
患者已接受並簽署同意書。
患者受益於社會保障聯盟。
非心栓性缺血性中風住院患者，需要根據通常的指南開始抗血小板治療。
排除標準
血小板異常。
血小板功能異常。
根據產品特性總結，抗血小板劑和/或至少一種輔料的禁忌症。
需要頸動脈內膜切除術和支架植入術的患者。
計數異常、血小板功能異常為排除標準。根據《產品特性總結》，任何關於抗血小板藥物和/或至少一種輔料的禁忌症均為排除標準。需要頸動脈內膜切除術和支架植入術的患者將被排除在外。
研究目標和終點
本研究的主要目的是描述非心源性缺血性卒中患者在使用抗血小板藥物前後的血小板超微結構標準。
次要目的是探討血小板超微結構變化與卒中預後的關係。
這項研究的主要終點是通過分析非心栓性缺血性腦卒中患者在抗血小板治療開始前後的透射電鏡圖像來收集血小板超微結構特征。
次要終點是在6個月的會診期間收集新的非心栓性缺血性卒中。
研究設計
研究者將向符合條件的患者提供關於電卒中研究的信息通知。研究設計概述在圖1．
樣品收集
在患者的書麵同意下，每次血小板分析需要收集20ml的血液，用檸檬酸管(檸檬酸鈉0.105M/3.2%，英國普利茅斯Becton Dickinson)。通過遵循GFHT和référence des病理斑塊中心(CRPP)的建議，將避免血液采集、運輸和處理過程中的人工激活過程。采集後立即用3%多聚甲醛、0.1%戊二醛和0.1M碳酸氫鈉固定血液。23
在抗聚集治療開始前和開始後5-8天采集血液，以確保藥物達到穩定劑量。
樣品製備
血小板樣本將進行電子透射顯微鏡(圖2)．處理富血小板血漿(Platelet rich plasma, PRP)。PRP將用2%的戊二醛和0.1M的碳酸氫鈉固定，1%的OsO4後固定，脫水並嵌入環氧樹脂(Delta顯微鏡，法國)。經過無鈾和檸檬酸鉛(法國德爾塔顯微鏡公司)處理後，將在200目formvar塗層銅網格(法國牛津儀器公司)上收集70納米超薄切片。將在透射電子顯微鏡(日立H-800)中引入一個柵極，並將在100kV下觀察。通過評估血小板膜的質量來優化圖像的質量和分辨率。超微結構標準將根據Neumüller建立的列表進行收集等．26
血小板標本製作流程:收集檸檬酸血，全血固定，製備富血小板血漿(PRP)，將樣品運至電鏡設備，PRP離心，取上清，洗滌步驟，固定後，洗滌步驟，脫水步驟，環氧包埋，70 nm超薄切片，與無鈾檸檬酸鉛對比，透射電鏡觀察，二維和三維分析，描述一種抗血小板治療的低生物反應性的超微結構特征和初步評價。2 d,兩個維度;三維、三個維度。
數據收集
研究期間收集的數據將記錄在電子病例報告表格中，該表格是為參與電卒中研究的患者創建的。住院期間，將注明年齡、性別和病史。收集疾病診斷日期、病理結果。
樣本量及統計分析
一組選定的非心栓性缺血性腦卒中患者將納入研究。陳等25已納入47名健康誌願者，以驗證MET-PC技術，並描述與基礎活性水平相關的血小板超微結構。在我們的研究中，47例患者也需要驗證該技術。以5%的技術可行性，50名患者將被納入。
評價標準是定性的。測量所研究標準的絕對頻率和相對頻率，其95%可信區間。
病人參與
倫理委員會(comité de protection des personnes d 'Ile-de-France VII)批準了將發給參與者的信息通知和本次試驗的協議(協議編號21-031)。
討論
透射電鏡的極限
當然，薄切片透射電子顯微鏡是耗時的，不能用於常規，但它可以幫助識別特定的超微結構變化。這些變化可以通過電子顯微鏡透射陰性染色、免疫掃描電子顯微鏡或流式細胞術進行分析，且耗時較少。
血小板激活的步驟
血小板活化是一個複雜的過程，涉及多個事件，如血小板與內皮下膠原的粘附、血小板形狀的改變、p選擇素和磷脂酰絲氨酸的膜外化、激動劑的合成或分泌導致多個信號通路的招募，以及激動劑與特定受體的結合。血小板活化的最後步驟是胞質環AMP濃度的降低，α2bβ3整合素的構象改變，允許纖維蛋白原的結合，通過血小板聚集誘導血栓的形成。纖維蛋白網絡是由凝血途徑的激活和聚集的結果。
超微結構特征根據活化程度而定
血小板活化的作用與超微結構的改變有關:血小板呈盤狀、開放小管係統的擴張、開放小管係統(OCS)的分泌、細胞器的集中。26我們希望用這些標準來明確地確定血小板的活化程度。這可以給我們提供有關抗血小板治療的生物學效率的信息。
抗血小板治療，對抗凝集物的生物反應差和超微結構特征
我們假設一種有效的抗血小板藥物會抑製與血小板活化相關的特異性超微結構變化。推薦用於缺血性腦卒中治療的抗血小板藥物會幹擾血小板活化的某些步驟。阿司匹林抑製COX1，並阻止花生四烯酸產生血栓烷A2。P2Y12受體可被氯吡格雷選擇性抑製。磷酸二酯酶被雙嘧達莫抑製。
無效的抗聚集血小板可能不會抑製血小板活化步驟。
我們從患者開始使用氯吡格雷治療後5 - 8天收集的血液中獲得了初步結果。對氯吡格雷反應較差和反應較好的血小板的超微結構特征已經顯示出來。19
對一個良好的氯吡格雷應答者的血小板進行處理，通過透射電子顯微鏡觀察血小板，並顯示出基礎活性的超微結構特征:呈盤狀，α和delta顆粒均勻分布，以及密集的管狀係統。透射電鏡圖像顯示，較差的氯吡格雷反應顯示中度激活，OCS重組和顆粒集中化。在電卒中中，抗血小板治療開始前後的血小板樣本將被評估。基線活性是得出抗凝血治療有效性結論的關鍵。
成像分析
每個網格至少含有80個血小板的圖像將是二維的，圖像J將根據標準化和驗證的程序進行分析，包括顆粒分析(表麵、Dmin、Dmaj、Dmaj/Dmin比)，由透射電子顯微鏡分析超微結構血小板的獨立專家進行分析。
將至少3名患者的10個70nm的血小板連續冷凍切片，獲得血小板細胞器的三維超微結構。這些圖像將使用Amira/Avizo軟件(Thermofischer scientific, Waltham, Massachusetts, USA)進行處理，以對齊圖像堆棧，分割細胞器，進行定量分析和3D渲染。
總之
我們提出了一種可靠的超薄透射電鏡來描述血小板的超微結構特征，評估抗血小板治療開始前後的血小板活性程度。這是總結抗血小板藥物對非心源性缺血性腦卒中患者療效的第一步。
倫理語句
發表患者同意書
致謝
這項研究得到了法國聖艾蒂安醫院的支持。
參考文獻
腳注
貢獻者NM撰寫了這份刊物。AG、ME、PG、PM參與臨床研究。GL提高了英語寫作能力。CS和OFH參與了協議的設置
資金法國聖艾蒂安大學醫院中心提供了經費。
相互競爭的利益沒有宣布。
患者和公眾參與患者和/或公眾沒有參與本研究的設計、實施、報告或傳播計劃。
出處和同行評審不是委托;外部同行評議。