條文本
PDF
摘要
簡介人類微生物群，即不同腔體中的微生物群落，與炎症和腫瘤疾病的聯係日益密切。雖然對腸道微生物組的研究一直很深入，但對泌尿係統微生物組的研究最近才被描述出來。膀胱癌(BC)與膀胱和腸道微生物組之間的關係的調查可能闡明兩者之間的病理生理關係。膀胱或腸道微生物組或兩者之間的相互作用也可以作為腫瘤行為的非侵入性生物標誌物。雖然這些關聯還沒有被充分研究，但泌尿科醫生已經通過操縱膀胱微生物組來治療BC超過40年，用膀胱內卡介苗免疫療法治療高級別非肌肉侵入性BC (NMIBC)。到目前為止，還沒有研究直接從膀胱組織取樣的微生物組與對bcg治療的反應之間的關係，也沒有研究對bcg治療的反應與糞便微生物組之間的關係。在開始bcg治療前仍需要一個預後工具。
方法與分析在NMIBC患者中，手術期間將收集膀胱樣本(膀胱微生物組評估)、糞便樣本(微生物組評估)、尿液和血液樣本(生物樣本庫)。我們將通過16S rDNA基因擴增測序分析微生物群落。將評估候選bcg之間的alpha多樣性(每個樣本中的物種多樣性)和beta多樣性(物種多樣性的變化)的差異。亞組分析將進行，這將導致臨床預測模型的發展，估計bcg反應的風險。
倫理與傳播該研究已獲得蘇黎世州倫理委員會(2021-01783)的批準，並根據《赫爾辛基宣言》和《良好臨床實踐》進行。研究結果將通過同行評審的期刊以及國家和國際科學會議傳播。
試用注冊號NCT05204199．
- 免疫學
- 微生物學
- 泌尿腫瘤
- 腫瘤學
這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名非商業(CC BY-NC 4.0)許可證發布，該許可證允許其他人以非商業方式分發、混音、改編、在此基礎上進行構建，並以不同的條款許可其衍生作品，前提是正確引用原始作品，給予適當的榮譽，任何更改都已注明，並且使用是非商業性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/．
數據來自Altmetric.com
本研究的優勢和局限性
這是最大的前瞻性觀察性研究，評估了接受bcg免疫治療的非肌肉侵襲性膀胱癌(NMIBC)患者的糞便和膀胱組織微生物群。
通過在不同的預定義時間點采樣，我們的縱向研究設計將允許我們確定微生物組變化的時間序列。
此外，將從無惡性腫瘤和低風險NMIBC患者中采集膀胱組織、尿液和血液樣本，以建立生物樣本庫，用於未來微生物組相關研究。
由於該研究的觀察性質，任何關聯可能都不是因果關係，需要在隨機對照試驗中進行評估。
無法預測的卡介苗短缺會影響研究進度。
簡介
背景及理論依據
膀胱癌(BC)每年影響全球約43萬人。1在診斷時，大約75%的檢測到的癌症將局限於尿路上皮或固有層，2他們是非肌肉侵入性BC (NMIBC)。不幸的是，20%的NMIBC會發展為侵襲性癌症，50%的侵襲性疾病患者會發生轉移。盡管進行了全身治療，轉移性BC的死亡率很高，中位生存期為12-15個月，5年生存率為5%。3.他們的發病率從50歲開始增加，然後從65-69歲年齡組到≥85歲年齡組幾乎翻了一番。4BC發展的確切病因尚不清楚。
尿路上皮暴露在外界環境中，與皮膚或肺上皮相似，使其容易受到環境毒素的損害。BC最主要的歸因風險因素是吸煙，每年約有50%的男女病例是吸煙引起的。5由尿路感染或尿路上皮刺激引起的慢性炎症也被認為是重要的危險因素，6盡管確切的機製尚不清楚。
人類微生物群，即不同腔體中的微生物群落，與炎症和腫瘤疾病的聯係日益密切。7 8
越來越多的證據強調腸道微生物組在泌尿係統疾病中的影響。9在前列腺癌患者的腸道菌群中擬杆菌massiliensis被發現是升高的Faecalibacterium prausnitzii而且真細菌rectale與健康對照組的水平相比有所降低10擬杆菌具有β-葡萄糖苷酸酶基因，當糖基化底物從肝髒到達大腸時，它會去除糖。無糖異種生物或誘變劑循環水平的增加被認為是導致前列腺癌的原因。11在Salgia的一項研究中等研究人員對接受免疫治療的腎癌患者的腸道微生物組的組成和多樣性以及治療反應進行了調查，發現較高的微生物多樣性與更好的治療結果相關，並且治療反應的特征是在治療過程中微生物物種的變化。12
雖然對腸道微生物組的研究一直很深入，但對泌尿係統微生物組的研究最近才被描述出來。13這些最近的研究結果支持了膀胱擁有自己的原生微生物群的新教條。14
有越來越多的研究調查良性泌尿係統疾病中的微生物群，15 - 20但迄今為止，隻有少數研究探索了泌尿係統微生物組在泌尿係統惡性腫瘤中的作用。21 - 25日徐等結果顯示，尿路上皮癌患者尿標本中鏈球菌豐度明顯高於健康人。21在另一項分析中流尿液的尿微生物組研究中，不動杆菌而且Anaerococcus與非癌症患者相比，BC患者的豐度更高。22
已知的致病因子鮑曼不動杆菌(包括外膜蛋白OmpA、磷脂酶、膜多糖組分、青黴素結合蛋白和外膜囊泡)有助於逃避宿主免疫反應。26
Anaerococcus據報道可誘導炎症和細胞外基質(ECM)重塑。27ECM、微生物組和炎症的相互作用可能在BC的發生、進展和複發中起關鍵作用。28
總的來說，BC患者的細菌豐富度增加。22這些發現與Zeng的研究結果一致等結果顯示，α多樣性低(單個樣本中微生物的變異)的患者比α多樣性高的患者無複發生存期顯著延長。29
40多年來，泌尿科醫生一直在利用膀胱微生物組治療BC，用膀胱內卡介苗(Bacillus Calmette和Guérin)免疫療法治療高級別NMIBC，卡介苗是一種活的減毒菌株牛結核分枝杆菌．30.據信，卡介苗可激活膀胱的先天免疫和後天免疫，從而對腫瘤細胞產生作用。31誘導療法最常見的方案是一個6周的療程。32雖然治療(維持治療)的劑量、頻率和持續時間一直存在爭議，但在最大限度地提高療效的同時最小化副作用(如尿頻、尿急、排尿困難、血尿和罕見(如卡介苗敗血症))仍然是一個挑戰。盡管采用卡介苗灌注治療，但複發率和進展率(卡介苗無反應或卡介苗失敗)約為40%33還有一個相關的臨床問題。34bcg無反應的NMIBC患者需要替代的膀胱保留方案。直到今天，卡介苗失敗後還沒有確定的替代膀胱內標準治療方法。根治性膀胱切除術和三聯療法仍然是預防疾病進展的唯一標準治療方法。35 36
目前，針對BCG無反應性疾病的試驗正在進行中，評估針對PD-L1或PD-1的免疫檢查點抑製劑與BCG聯合靜脈注射或靜脈注射的應用。33
尿液、臨床和血清為基礎的生物標誌物預測卡介苗的反應已經進行了研究。其中，隻有臨床病理特征(如吸煙者與非吸煙者)和尿細胞因子特征與緩解率顯著相關，盡管沒有一項被廣泛應用於臨床實踐。37
卡介苗治療開始前仍需要一個預測工具。這將避免沒有預期治療益處的患者不必要地接受BCG治療，使他們免受BCG副作用的風險，並為調整上述BCG無反應試驗的招募標準以加速替代膀胱保留療法的臨床實施提供了可能性。最後，它將有助於緩解卡介苗短缺的反複出現的問題。38
在最近發表的一份國會文件中，39Sweis等評估了NMIBC患者尿液微生物組的組成，並評估了與卡介苗治療反應的相關性。他們可以表明，通過操作分類單位對距離進行的全局分析表明，複發和非複發患者之間存在顯著差異。
到目前為止，還沒有研究直接從膀胱組織取樣的微生物組與卡介苗治療反應之間的關係，也沒有研究卡介苗治療反應與糞便微生物組之間的關係。基於這兩種微生物特征組合的預測模型也從未被提出過。
目標
我們的主要目的是研究使用來自NMIBC患者膀胱和糞便的微生物譜作為潛在的二元分類係統，將BCG候選人群分為“預期BCG應答者”和“預期BCG無應答者”組，以預測BCG施用前的治療應答。
我們的第二個目標是收集更多的樣本(血液、尿液、膀胱組織、糞便)，為未來的微生物組項目建立一個本地生物樣本庫，這些項目的重點是確定生存結局預測因素，研究NMIBC患者中改變的微生物組的病理生理和代謝特性，以及它們對卡介苗治療反應或失敗的影響，符合人類微生物組項目40以及綜合人體微生物組項目。41
研究設計
該研究將在蘇黎世大學醫院(USZ)作為單中心研究啟動。在啟動階段後，我們將把研究擴展到瑞士其他中心。
為了了解微生物群對癌症治療反應的差異和影響，並為未來的微生物組項目建立本地生物庫，我們將收集臨床數據、血液、尿液和糞便樣本以及手術切除樣本。我們將包括接受非腫瘤性膀胱手術或經尿道前列腺切除術(turp)的無泌尿係或胃腸惡性腫瘤患者(a組);低危NMIBC患者(B組)和計劃接受卡介苗治療的NMIBC患者(C組)。
方法與分析
招募和同意
全部患者招募將在USZ進行。
“Klinik für Urologie”的項目負責人和同事將招募沒有泌尿或胃腸道惡性腫瘤的患者，接受非腫瘤性膀胱手術或turp (a組);低危NMIBC患者(B組)和NMIBC患者作為bcg治療的候選患者(C組)。
研究信息將在第一次會診時提供;因此，患者將有足夠的時間考慮。在術前的標準化會診時間，患者將再次被告知研究程序，並有足夠的時間提問。接下來，將獲得書麵知情同意。
所有患者在進行任何項目特定評估或程序之前，必須簽署最新的倫理委員會批準的書麵知情同意書並注明日期。參與者不會通過參與而獲得任何好處，但它可能對未來的患者有很大的好處。這些信息將在患者信息中明確說明。參加是自願的，不影響醫療。參與者可以在研究的任何時候退休
合格標準
一般納入標準
符合以下所有納入標準的受試者可被納入本項目:
簽署的知情同意書。
能夠理解和遵循研究程序，理解知情同意。
年齡18-90歲。
一般排除標準
如果受試者符合以下任何一個排除標準，他/她可能不被包括在內。
最近一個月內接受過抗生素治療。
過去6個月內接受過免疫治療或化療。
免疫抑製治療。
需要持續治療的重大內科、腫瘤性(皮膚癌除外)、外科或精神疾病。輕微的，控製良好的情況，如醫學控製的動脈高血壓或職業性哮喘，可能存在。
已知影響腸道或膀胱微生物群的其他主要診斷(如肝硬化、係統性硬化症、炎症性腸病、炎症性腸綜合征、腹腔疾病、神經性膀胱)。
過去主要的腸道手術，特別是在小腸或結腸。可能有膽囊切除術、闌尾切除術、肛周手術史或疝修補史。
主要胃腸症狀(腹瀉、便秘、腹痛、嘔吐、原因不明的體重減輕、直腸出血或便血)。
擴膀胱手術。
留置導尿管。
類屬特異性的標準
我們將納入符合納入標準的患者為以下組之一:
A組:無泌尿係或胃腸道惡性腫瘤，接受非腫瘤性膀胱手術或turp，符合以下標準的患者。納入研究時，無泌尿係統症狀或相關泌尿係統疾病(不明確的大量血尿、膀胱結石、前列腺癌)。
B組:低危NMIBC(原發性，孤立性，Ta/低分級< 3cm，無原位癌(CIS))。
C組:NMIBC患者，卡介苗候選人，評估為中等風險(介於低風險和高風險之間)或高風險(T1或高級別或CIS或多發性，複發和大(>3 cm) Ta/低級別腫瘤)。
樣品收集
我們將從每個糞便和turb樣本中提取微生物DNA(通過子宮內膜腫瘤切除獲得)。我們將從沒有泌尿係統惡性腫瘤的參與者(A組，非腫瘤膀胱手術和turp候選人)的膀胱組織中取樣。將從膀胱頸部取樣。對於NMIBC患者(B組和C組)，我們將從腫瘤內部和鄰近的正常組織中提取樣本。對於有一個腫瘤/乳頭狀病變的患者，從病理學家確認的腫瘤內(癌變組織)和距離病變到膀胱頸部5cm的腫瘤周圍(非癌變組織)取樣。對於患有多發性腫瘤的患者，將從最明顯的病變(大小和結構)中抽取癌變組織樣本，由病理學家確認是否存在腫瘤，並將5厘米外的非癌變組織樣本投影到膀胱頸部。在基線隨訪期間，使用消毒的柔性膀胱鏡收集尿液;對於術前未進行膀胱鏡檢查的患者，在手術期間通過切除鏡收集尿液，在卡介苗通過一次性導管灌注之前(C組)收集尿液。對於糞便采樣，將指導患者，並提供信息傳單。研究進度表顯示了計劃樣本收集的概述(表1)．
血液(2×10 mL為血漿，10 mL為血清)將在各自的程序之前抽血，並在可能的情況下結合醫學所需的抽血。
微生物群落的分析將通過16S rDNA基因擴增子測序進行，如統計部分所述。
我們將對來自卡介苗候選人群的樣本進行基線分析。我們將在第一次卡介苗誘導療程後重複糞便分析，並對卡介苗失敗的患者再次進行糞便分析，並對re - turb樣本進行16S rDNA基因擴增測序。
統計計劃
樣本量測定
本研究的主要終點是利用16S rDNA基因擴增子測序，評估BCG應答者和非應答者(BCG失敗)之間微生物組組成的差異。
卡介苗失效分為兩類:
複發:定義為在膀胱內卡介苗治療開始後，經組織病理學證實發現任何腫瘤，不論分級或分期。
進展:定義為肌肉侵襲性疾病階段的增加。
由於微生物組組成的組內變化以及組間的效應大小是不確定的，難以預測，我們進行了Kelly概述的冪分析等．42我們使用微冪R包進行不同效應大小的模擬，計算每組被試人數對應的PERMANOVA冪。我們每組使用5、15、30名受試者，每組受試者越多，力量就越強(見圖1)．對於兩組比較，我們預測，如果我們每組包括30名患者，我們將獲得90%的冪，使我們能夠檢測到0.035的效應量(ω2)，這是一個保守的效應量假設，將小於在其他微生物組研究中觀察到的效應。因此，為了增強統計能力，我們計劃每年每組招募30名患者。主要研究的樣本量將達到60例，另外60例(A組30例，B組30例)，以建立當地的生物樣本庫，用於未來的後續微生物組項目，包括但不限於鑒定生存結果預測因素。
模擬-輸出不同效應量，計算每組受試者數量對應的PERMANOVA冪。置換的多變量方差分析。
統計方法
對於微生物組分析(16S rRNA測序)，將使用香農指數評估卡介苗候選人之間的alpha多樣性(每個樣品中的物種多樣性)的差異，該指數結合了豐富度和多樣性，測量物種數量和物種豐度之間的不平等(對於兩個以上的組比較，將使用Mann-Whitney檢驗或Kruskal-Wallis檢驗確定顯著性)。組間微生物組組成的差異將通過計算幾個距離指標來估計，如加權UniFrac距離和加權Jaccard距離。然後將使用多變量方差分析(PERMANOVA)和組間相似性分析來分析組間差異。Qiime2分析管道將用於檢查序列質量和稀有分數，以確保所有樣品都有足夠的測序深度。
亞組分析將作為二次分析進行:我們將分析吸煙狀況(吸煙vs不吸煙)和性別(男性vs女性)。進一步分析有BCG應答者和無BCG應答者亞組(複發組和進展組)之間的α和β(樣品間微生物群落的變化)多樣性差異，分析無BCG應答者患者的微生物組變化，分析第一個BCG誘導周期後糞便微生物組的變化。
這些預測指標和以下變量的組合:年齡，性別(男性，女性)，分期(Ta, T1)， CIS(是，否，僅)，等級(高，低)，吸煙狀態(是，否)，然後將用於開發臨床預測模型，以估計卡介苗反應(或無反應)的風險。在模型開發之後，我們將對內部有效性進行自舉估計。模型開發將根據PROBAST(預測模型風險偏差評估工具)的建議進行。43
丟失數據的處理
在達到每組“項目參與者”的最終人數之前，新招募的人員將取代退出的人員。初級分析不會使用數據缺失的個人。然而，如果統計上合適的話，二次分析(例如，基線時微生物組特征的比較)可能會使用這些個體的數據。
參與者的時間表
所安排的探訪及評估情況見表1．
數據管理係統
在本項目中，將使用電子數據捕獲軟件REDCap (Research electronic data capture)(範德堡大學)進行數據處理和管理。
患者和公眾參與
患者和公眾均未參與研究方案的製定。
倫理與傳播
道德
該研究已獲得蘇黎世州倫理委員會(2021-01783)的批準，並將按照現行版本的《赫爾辛基宣言》所闡述的原則和瑞士監管機構的要求進行。中央倫理委員會(CEC)將根據當地要求通知研究停止/結束。每項實質性議定書修正案將在實施前通知CEC批準。
傳播計劃
在研究完成後，我們打算在國家和國際泌尿學會議上以口頭交流和摘要的形式展示結果，並將結果發表在同行評審的期刊上。
倫理語句
患者發表同意書
參考文獻
腳注
推特@UweBieri
貢獻者UB, MS和CP撰寫了研究方案。CP是這項研究的主要研究者。UB負責臨床試驗的運行和協調研究人員。UB以日誌格式起草了協議。YM製定了統計計劃，並在研究方案中撰寫了統計部分。SS, BMS, YM, JHR, PHS, MK, LJH和DE對手稿的修改做出了貢獻。
資金這項研究獲得了“瑞士癌症研究基金會”的全額資助。
相互競爭的利益沒有宣布。
患者和公眾參與患者和/或公眾沒有參與本研究的設計、實施、報告或傳播計劃。
出處和同行評審不是委托;提交前需經過同行評審，以獲得倫理和資金批準。