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介紹肺結核所致結核分枝杆菌是一種常見的傳染性疾病與重要的發病率和死亡率,尤其是在低收入和中等收入國家。成功治療的疾病需要長期攝入(6 - 8個月)與潛在的有害後果多種抗生素成分和功能潛在的人類微生物組。在當前的研究中描述的協議旨在識別微生物(口腔和腸道)簽名與結核病發病機製有關,治療反應和結果。
和分析方法四百五十年,新診斷結核病患者從三個地區水平(白沙瓦,馬爾丹和斯瓦特)結核病診斷和治療中心,將招募non-interventional,前瞻性隊列研究,並將跟蹤和監控,直到完成治療。人口和膳食攝入數據、人體測量和血液、糞便和唾液清洗樣品將收集的基線,15天,第2個月,結束治療。此外,我們將招募年齡(±3年)和sex-matched健康對照組(n = 30)。血液采樣將允許監測免疫反應治療期間,而唾液清洗和糞便樣本將允許監測口腔和腸道微生物多樣性的動態變化。在這個前瞻性隊列研究中,一個嵌套病例對照研究設計將在口腔和腸道微生物多樣性進行了評估擾動(微生物生態失調)和免疫反應並比較患者組之間(治療成功與失敗)。
道德和傳播這項研究獲得了道德倫理委員會的批準開伯爾醫科大學白沙瓦和行政批準省級結核病控製項目的開伯爾-普赫圖赫瓦省,巴基斯坦。研究結果將在國家和國際會議和發表在同行評議期刊。
試驗注冊號碼NCT04985994。
- 肺結核
- 微生物學
- 協議和指南
- 診斷微生物學
- 營養和營養學
- 呼吸道感染
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來自Altmetric.com的統計
本研究的優點和局限性
前瞻性研究設計與足夠大的樣本容量和抽樣頻率,以確保準確的捕捉任何新興微生物生態失調和免疫調製的照片。
除了微生物簽名,集社會人口、人體測量、營養和並發症數據將允許進一步的亞組分析和有意義的結果。
一個潛在的缺點是,並不是所有的病人可能能夠提供樣品的所有指定的時間點。
另一個弱點是提出一些參與者將收回的可能性由於這項研究是進行資源貧困社區。
介紹
結核病,由細菌引起的結核分枝杆菌(Mtb)是一個全球性的公共衛生問題,第二個最常見的死亡原因在人類的傳染病艾滋病。1據估計,世界人口大約四分之一(24.8%)的結核分枝杆菌潛伏感染沒有臨床症狀和最小的機會感染他人。2其中,5% -10%可發展為活動性疾病(特點是結核病的臨床症狀和體征或微生物感染結核分枝杆菌的確認或兩者)在某個階段的生活,特別是當免疫係統受損由於老化,艾滋病毒感染和營養不良。3根據2020年全球結核病的報告,大約有1000萬例新病例被診斷出肺結核的2019年,其中140萬隨後死亡。1結核病問題更嚴重,在低收入和中等收入國家,包括巴基斯坦。在全球範圍內,巴基斯坦排名第五的結核患病率在2019年與000年估計有570新病例報告1從而構成一個很大的負擔已緊張的國家醫療體係和經濟。
結核病發病機製是一個複雜和動態的過程包括幾個階段,包括疾病的易感性,感染、潛伏或活動性疾病和治療反應失敗。4Mtb能夠逃避免疫係統在漫長的時間,甚至幾十年曝光後,潛伏性結核病的形式。5一旦激活,疾病是最難治療感染需要多種藥物治療,隻要6 - 9個月。然而,治療失敗是頻繁的(即使堅持抗生素治療是維護)為15%,藥物容易感染為31%,耐藥結核病例。6 7因此,在一些人群中,死亡率是12%左右。8此外,複發和結核病複活也常見的公共衛生問題。9雖然,許多因素調節的風險疾病的發展從一個階段到另一個記錄,底層生物調節器的風險仍然是難以捉摸的尤其是對微生物。10新出現的證據表明,微生物可能發揮重要作用在結核病發病機製以及治療反應和結果,主要是由於多方麵的病原體之間的相互作用,微生物和宿主免疫反應。4日11
人類微生物組有各種共生的財團的微生物(細菌、古細菌、病毒和真菌)殖民不同棲息地的人體,如皮膚、腸道和粘膜表麵。12最近的技術進步帶動文化無關宏基因組測序技術加上曾經的測序成本下降(自2001年以來減少200 000倍)13極大地改善我們的理解微生物的至關重要的作用在人類健康和疾病。人們相信人類和他們的互利共生的微生物密切相關。14人類宿主為微生物群提供了溫暖和營養豐富的居住環境。另一方麵,微生物起著重要的作用在刺激免疫係統功能的發展(包括先天和適應性免疫係統),這是至關重要的維持宿主共生。腸道的微生物群提供了必要的營養因素(如維生素)和提高主機從食物中提取能量的能力。的確,現在有相當多的證據表明人類微生物組的影響,直接或間接,各種主機的開發過程包括晝夜節律性和營養,代謝和免疫反應。15 - 17日此外,微生物可以起到這樣的作用不僅在本地還在遙遠的身體通過gut-lung網站,腸腦和/或gut-liver軸。因此,任何擾動微生物成分或功能潛在的可能導致致病性感染和免疫反應,改變也可以起到至關重要的作用在發展非傳染性疾病從代際肥胖免疫介導性疾病,甚至癌症。17微生物在不同的身體失調,如口腔和腸道,也報告了有關的結核病並發症如糖尿病18和營養不良。19然而,到目前為止,很少有研究關注的作用關鍵微生物社區應對結核感染。
在人類腸道微生物生態失調結核病感染被Dubourg首次報道等。20.使用文化相關的和獨立的方法,他們發現貧困的腸道微生物群居住在一個結核病患者接受抗結核治療。然而,這項研究包括人類隻有一個主題(一個63歲的女性)與耐多藥結核病。病人也在廣譜抗生素治療前4個月,目前還不清楚到什麼程度減少腸道細菌多樣性是由於抗生素治療耐多藥結核病,營養狀況或其他共病情況。另一項研究還發現結核分枝杆菌顯著改變腸道微生物多樣性老鼠感染模型,其中16 s-rrna-gene下一代測序(上天)顯示感染後腸道微生物多樣性迅速降低。建議這種效應產生的免疫信號從肺腸21通過所謂的“gut-lung軸”,改變在一個微生物引起的免疫反應和改變成分調整。最近的一項研究等發現獨特的腸道微生物組簽名和代謝功能,預測患者結核分枝杆菌的感染結核病。22同樣,口腔厭氧菌等普氏菌發現了豐富的下呼吸道的艾滋病患者接受抗逆轉錄病毒治療。人口從這些細菌代謝產物,如丁酸等短鏈脂肪酸,是與這些患者的結核病感染的易感性增加有關。23另一方麵,幽門螺杆菌潛伏性結核病患者感染被認為是預防疾病的進展,從潛伏在人類活動性結核病。24所有這些發現可能相關的微生物群的作用的理解結核病發病機理、複發和再活化。然而,直到現在,沒有強有力的證據表明是否有任何重大人類微生物組和免疫係統之間的相互作用,影響結核病感染的易感性,結核病惡化和反應過程中抗結核治療。
因此,本研究旨在分析微生物群之間的關係(口腔和腸道)及其與免疫係統的相互作用在人類結核感染和抗結核治療。
目標
主要目標
這項研究的主要目的是探索結核病感染的效果和抗結核治療口腔和腸道微生物多樣性和功能的潛力,和免疫反應從巴基斯坦新診斷結核病患者。
二級目標
確定口腔和腸道微生物多樣性和功能潛在的基線,與健康對照組比較。
評估口腔和腸道微生物之間的關係和社會人口特征和膳食攝入量在結核病患者基線,在抗結核治療的開始。
來描述任何口腔和腸道微生物生態失調的發生及其與不良反應和治療失敗患者的結核病。
識別特定的口腔和腸道菌群與不良反應和不利的治療結果。
和分析方法
研究設計和設置
微生物的易感性,肺結核患者治療反應和結果(Micro-STOP)的研究是設計為以人群為基礎的前瞻性群組研究新診斷結核病患者在三個區級(白沙瓦,馬爾丹和斯瓦特)結核病診斷和治療中心的開伯爾-普赫圖赫瓦省省的巴基斯坦。選擇這些中心是基於2020年結核患病率最高。參與網站大約每年治療2500結核患者。
這項研究將作為一個持續的合作開伯爾醫科大學白沙瓦,巴基斯坦,結核病控製規劃開伯爾-普赫圖赫瓦省和雷丁大學,英國。結核病控製規劃是開發和實現的主體為結核病的預防和管理政策和策略,以及管理整個省結核病診斷和治療中心。結核病控製項目負責病人識別、臨床數據和進一步研究樣本的集合。開伯爾醫科大學是唯一的公共部門醫科大學和醫療研究和教育中心。雷丁大學的將分析數據如下解釋方法論部分。Micro-STOP研究始於2021年8月,數據收集計劃,直到2022年8月達到所需的樣本量。
樣本大小
由於嚴格的納入和排除標準,和缺乏類似的研究,統計力量無法計算準確。因此,我們跟隨樣本量計算的實用方法。先前發表的文獻表明,宏基因組研究樣本量30足以觀察表型異質性在分子水平上。25我們旨在招募了450名結核病患者的基礎上7%的結核病治療失敗率在巴基斯坦,1達到足夠數量的觀察表型差異相應微生物組(治療失敗與成功)。此外,我們還將招聘30名健康對照組。
研究人群
我們旨在招募了450名新診斷,治療的結核病患者選擇中心結核病治療設施的開伯爾-普赫圖赫瓦省省的巴基斯坦。群將在第一行抗結核治療在不同時間點到治療結束。治療完成後,將進行一個嵌套病例對照研究之間的患者治療成功與失敗。根據結核病治療失敗率在巴基斯坦,1我們將得到足夠數量的患者治療失敗比較微生物與成功的治療結果。此外,為了識別微生物組在結核病發病機理中的作用,我們將評估微生物多樣性的新診斷結核病患者沒有曆史的廣譜抗生素使用2月(n = 30)和與控製(n = 30)。控製將健康受試者沒有肺結核的曆史,對性別和年齡匹配(±3年)結核病患者組。他們會隨機選擇從非家族成員鄰國的病人。一個人將從5到7提出了隨機選擇健康對照組。
入選標準
參與者將被包括在這項研究如果:
被診斷為肺結核詳細曆史收集後,臨床檢查和實驗室評估(痰培養陽性)。
18 - 65歲。
願意參加這項研究。
健康對照組那些免費的結核病症狀,健康體檢並提供一個負麵痰培養結果。
排除標準
參與者將被排除在外,如果他們是:
以前已經在抗結核治療或治療結核病。
嚴重貧血(血紅蛋白(Hb) < 10 g / L)。
有腹瀉或其他主要胃腸道功能紊亂。
用醫學上規定飲食或營養補充劑。
懷孕或哺乳期婦女。
患者肝髒或腎髒功能障礙,或其他慢性疾病的狀態。
額外的肺和耐藥性結核病患者。
研究和抽樣程序
總體概述研究流和行為提出了圖1。病人將招募的日常由各自網站協調員在結核病診斷和治療提供臨床專家。
這項研究的流程圖。肺結核,肺結核。
所有臨床或輻射跡象暗示的結核病患者將接受痰塗片鏡檢和愛視寶MTB / RIF化驗證實診斷結核病的國家結核控製規劃後修訂的指導方針在巴基斯坦對結核病的控製。塗片鏡檢用人Ziehl-Neelsen(鋅)染色法來識別痰塗片抗酸的細菌是一種快速、簡單和成本有效的方法對肺結核的診斷在低收入和中等收入國家。26愛視寶MTB / RIF試驗(造父變星,森尼維耳市,加利福尼亞,美國)是世衛組織建議,pcr進行同步鑒定結核分枝杆菌的分子診斷技術和利福平耐藥性(即突變的rpoB多藥耐藥性基因作為代理)在臨床樣本。27根據國家結核控製規劃指南,28所有患者接受第一行抗結核治療組成的2個月和4個月繼續強化階段階段。生物樣品將收集的基線,在治療結束時所示圖1。醫生會向病人解釋樣本收集過程在當地語言。病人將被要求提供5毫升無菌的遊離痰,50毫升塑料罐螺旋帽。鋅痰塗片染色將執行和報告將基於美國胸腔協會的指導方針29日中描述的表1。
所有滿足資格標準的患者將被邀請參加這項研究由訓練有素的研究助理。研究參與者信息表包含所有細節和過程在一個易於理解,當地語言(普什圖語)將提供給所有的參與者。研究過程也將向參與者口頭解釋。一旦同意,參與者將被要求簽訂書麵知情同意的首選語言形式。
社會人口和人體測量數據的集合
參與者的社會人口信息如姓名、年齡、性別、種族、教育、職業和家庭收入將使用結構化的問卷收集的研究助理。收集到的數據將隻在基線開始前抗結核治療。表2概述的學習行為和時間表。包括人體測量身高和體重也會記錄以下標準方法。為了記錄高度,病人會被要求刪除鞋和頭巾(帽子、圍巾等),站舒適與固定在牆上的測距儀(Seca,漢堡,德國)與高跟鞋,臀部,肩胛骨和後腦勺碰到垂直背板(法蘭克福平麵位置)。身高將然後測量到最近的0.1厘米。同樣重量的測量,病人將被要求脫鞋和任何額外的塊布和珠寶。重量將會記錄在公斤到最近的0.1公斤使用校準電子秤(Seca)。身體質量指數(BMI)將計算分數的單位為千克的重量的平方米(公斤/米的高度2)。所有的人體測量數據將被收集在所有四個時間點由兩個訓練有素的研究助理在每個站點上。
膳食評估
因為沒有有效的食物頻率問卷用於巴基斯坦、膳食攝入量的參與者將被評估使用24小時膳食回憶法訓練的營養師。24小時膳食回顧將進行深入訪談的形式使用標準化協議四個階段。30.這個過程通常需要20 - 30分鍾左右才能完成。努力將列出所有食品和飲料的消費在過去24小時內。這將包括記錄的信息有關的所有食品和飲料消費,原料,烹飪方法和品牌的商業食品。每個食品或飲料消費的金額將在參考估計普通大小的容器(碗,杯子和眼鏡),標準測量的杯子和勺子,艾滋病(照片)和二維三維食品模型。飲食攝入量評估將在所有四個時間點執行。
樣品收集
血
非,整個血液樣本將由一個訓練有素的收集抽血者使用蝴蝶針和塑料真空采血管(雙相障礙診斷、瑞士)。至少5毫升的血液將來自一個肘前的靜脈進入pre-chilled集合管含有矽凝活化劑。全血將被送到當地的實驗室完成血細胞計數。分離血清,血液樣本將留在冰30分鍾離心緊隨其後。整除的血清樣本(250µL)將準備和存儲在KMU−80°C到進一步的處理主要的實驗室。
凳子
所有的參與者將被要求提供一個糞便樣本的四個時間點。為此,糞便樣本收集工具將提供包含一組,塑料袋,一次性手套和一個指令表的首選語言。參與者將被要求通過整個排便到塑料罐和完成時關閉蓋子。集合後,樣品將會移交給研究助理或在當地學習網站(結核病中心)進行進一步處理。研究助理將糞便樣本的一部分轉移到10毫升螺旋蓋管(珠寶首飾管)的幫助下mini-spoon蓋子。蓋子將關閉緊密,管子將被放置在塑料袋和轉移到主要實驗室維護冷鏈。在實驗室裏,整除的樣品(200毫克)將存儲在−80°C進行進一步處理。
口腔衝洗
口腔衝洗將收集到的所有患者的樣本在所有時間點使用標準的方法。31日在樣本收集之前,病人將指示避免吃食物,喝水(特別是調味和碳酸飲料),口香糖和使用煙草製品至少1小時前示例集合。他們將被要求漂亮(不含漱劑)10毫升無菌磷酸鹽緩衝鹽水(PBS) 1分鍾,並咳出痰口的內容到50毫升離心管。收集的樣本將渦(3×30年代),和每個收集樣本將離心機在14 g 000 x 10分鍾在4°C pelletise微粒從細胞外可溶性部分和獨立組件(上層清液)。合成細胞顆粒將被凍結在−80°C到使用。
實驗室分析
血液學的和生化參數
全血樣品將用於完成血液計數,Hb,血細胞壓積和平均微粒體積測定使用一個自動化的血液學分析儀(Sysmex xp - 100、新加坡)。血清鐵、鐵蛋白、轉鐵蛋白、C反應蛋白和α1-acid糖蛋白將使用商用套裝在一個雅培化驗師ci8200自動化分析儀(雅培,雅培公園,伊利諾斯州,美國)在馬爾丹醫學複雜,馬爾丹,巴基斯坦。微量元素狀態的病人也將評估在所有四個時間點。維生素A和D將通過ELISA評估而血漿鋅和其他礦物質將使用電感耦合等離子體質譜法測量設備讀大學,英國。
評估的免疫狀態
宿主的免疫狀態將由全血細胞計數和測量評估小組促炎(IFN-γTNF-α和il - 6)和血清中抗炎細胞因子(il - 10, TGF-β1)水平。這些細胞因子的選擇是建立在最近發表的研究顯著差異水平觀察活動性結核病患者和健康對照組之間。17血清細胞因子的濃度將測量後的夾心ELISA技術製造商指示。
DNA提取和16 s rRNA測序
細菌基因組DNA提取的口腔衝洗和糞便樣本(200毫克)存儲在使用ZymoBIOMICS−80°C DNA Miniprep工具包(美國加州Zymo研究,歐文)後,製造商的指示。每個樣本將量化使用Denovix和quality-checked通過瓊脂糖凝膠電泳和PCR 16 s rRNA基因的目標。準備的樣品測序,基因組DNA將用於放大V1-V3地區使用戈利的16 s rRNA基因編碼通過常規PCR引物。32放大樣品將被瓊脂糖凝膠電泳分離引物二聚體的DNA樣本。每個DNA樂隊將提取和純化使用QIAquick凝膠萃取工具包(貓。不。28 705德國試劑盒)。淨化後,每個樣品的濃度將使用Nanodrop量化。濃度的樣品將被標準化的最低2.5 nmol。集中樣本將會受到高通量測序在Illumina公司Miseq平台上用2×300基地讀取使用V3化學作為指定的製造商(Illumina公司,聖地亞哥,加利福尼亞,美國)Rehman醫學研究所,白沙瓦。數據輸出將去複用內置等軟件。
門店數據分析
去複用序列數據將使用開源軟件處理和分析管道定量見解微生物生態學2 (QIIME 2) (http://qiime2.org)31日如下。正向和反向讀取使用fastq-join將合並,然後接受質量過濾使用最低phr 20的質量分數。讀取將被分配到擴增子序列變異使用內置的解模糊命令QIIME2 99%相似度閾值。分類作業將使用當前細菌綠色煤電數據庫實現。α和β多樣性測試,所有樣品將子樣品同等數量的讀取。β-Diversity分析將由主坐標分析加權Unifrac相似矩陣和隨後的置換多元方差分析使用微生物分析師網絡平台(https://www.microbiomeanalyst.ca/)。單變量分析也將執行使用微生物分析師和顯著差異選擇Bonferroni調整。不同的影響因素,如年齡、性別、體重指數疾病嚴重程度等對微生物多樣性將被評估使用廣義線性模型。33分析統計的差異在不同的分類和功能水平將使用的宏基因組資料統計分析使用費舍爾的確切的測試以及層的錯誤發現率在95%置信區間(羅斯福)校正。34我們將尋求識別任何收集元數據之間的相關性和使用典型對應分析或冗餘分析微生物組成35並識別任何腸道/口腔微生物群的趨勢與不利的結核病治療結果使用隨機森林方法。測序文件和相關的元數據會被放置在一個適當的數據庫(例如,NCBI BioSample數據庫)的出版物。
描述性數據包括社會人口、臨床和實驗室數據將被描述為頻率和百分比。根據數據類型(量化和分類),適當的統計檢驗(學生的學習任務和皮爾森和χ2測試)將被應用到比較兩組之間的差異。
病人和公眾參與
社區成員或病人沒有直接參與研究設計、實施和結果的措施。然而,協議是審查和批準的省級結核病控製項目的開伯爾-普赫圖赫瓦省,巴基斯坦。臨床醫生和項目經理的結核病控製規劃與病人密切聯絡,作為研究者和病人之間的橋梁。他們有重大貢獻在設計數據收集問卷,知情同意,並確保機密性。報告的研究結果對臨床實踐產生積極的影響將在年度報告衛生會議通過臨床醫生和患者溝通。然而,個人數據將不會報告給病人。
道德的考慮
倫理批準這項研究已經取得倫理委員會的開伯爾醫科大學(DIR / KMU-EB /公關/ 000858)。參與者信息表將提供給所有病人的首選語言(烏爾都語,普什圖語)。信息表包含了所有相關信息的確切性質研究過程、潛在的風險和利益相關和誰聯係在緊急情況下或進一步的信息是必需的。研究過程也將由臨床人員口頭解釋和研究助理和將回答任何查詢。一旦同意被包括在這項研究中,參與者將獲得書麵知情同意。簽署知情同意將過時,參與者和研究助理的信息的參與者。在這種情況下,參與者不能(文盲)簽署同意書,拇指印。知情同意清楚地表明,病人的參與研究純粹是自願和他/她沒有任何理由可以隨時退出研究,決定不會影響他/她接收的標準治療。
傳播
我們打算在國際發表研究結果,可用的同行評議期刊。的數據也將在科學會議和研討會。
倫理語句
病人同意出版
引用
腳注
女士和SCA是共同第一作者。
貢獻者女士和SCA構思項目理念和研究方法。ZU-H負責招聘的研究參與者,樣品和數據收集。所有作者閱讀和批準這個手稿的最終版本。
資金這項研究是由高等教育委員會巴基斯坦國家大學研究項目基金(沒有:10289 /肅貪會/ NRPU /研發/ HEC / 2017)。
相互競爭的利益沒有宣布。
病人和公眾參與病人和/或公眾沒有參與設計,或行為,或報告,或傳播本研究計劃。
出處和同行評議不是委托;外部同行評議。