條文本
PDF
摘要
簡介瘧疾是撒哈拉以南非洲地區的主要公共衛生問題之一。在受影響國家，它大大增加了孕產婦和胎兒發病率和死亡率。本研究旨在評估在前瞻性研究設計中使用稱為環介導等溫擴增(LAMP)的分子檢測增強病例檢測對分娩結果的影響。
方法與分析一項實用的隨機診斷結果試驗將在埃塞俄比亞不同地區的幾個衛生機構進行。處於妊娠早期和中期的婦女(n=2583)將被納入研究，並單獨隨機分配到標準護理組或加強病例檢測組，並隨訪至分娩。報名時間將包括瘧疾傳播高峰季節。在護理標準部門中，將僅在有症狀的患者中收集靜脈血樣本用於瘧疾診斷。相比之下，在幹預組，無論母親在每次產前保健訪問時出現何種症狀，都將使用商業上可用的Conformité Européene (CE)批準的LAMP瘧疾測試、顯微鏡和瘧疾快速診斷測試對其進行測試。這項研究的主要結果是測量出生體重。
倫理與傳播該研究由以下倫理研究委員會批準:阿莫爾漢森研究所/ALERT倫理審查委員會(FORM AF-10-015.1，協議號PO/05/20)，埃塞俄比亞科學和高等教育部國家研究倫理審查委員會(批準SRA/11.7/7115/20)，埃塞俄比亞食品和藥物管理局(批準02/25/33/I)， UCalgary聯合健康研究倫理委員會(REB21-0234)。研究結果將與埃塞俄比亞衛生部、創新診斷基金會、世衛組織瘧疾多邊倡議——熱帶病研究(TDR-MIM)、遏製瘧疾和孕期瘧疾聯盟等機構和利益攸關方分享。研究結果還將發表在同行評議的期刊上，並在國際會議上發表。
試用注冊號NCT03754322．
- 診斷微生物學
- 分子診斷
- 熱帶醫學
這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名非商業(CC BY-NC 4.0)許可證發布，該許可證允許其他人以非商業方式分發、混音、改編、在此基礎上進行構建，並以不同的條款許可其衍生作品，前提是正確引用原始作品，給予適當的榮譽，任何更改都已注明，並且使用是非商業性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/．
數據來自Altmetric.com
本研究的優勢和局限性
這是同類研究中規模最大的基於前瞻性結果的研究，旨在研究在沒有IPT的情況下，孕期瘧疾分子檢測的影響。
低瘧疾陽性率可以最大限度地減少研究的影響，而在季節性研究地點的瘧疾高峰進行研究的時間至關重要。胎盤損傷發生在懷孕早期，最佳的研究影響將發生在懷孕前三個月的婦女。
環介導等溫擴增(LAMP)技術不能區分寄生蟲的有性和無性階段。
C
簡介
根據世界衛生組織的數據，2019年全球報告了約2.29億例瘧疾病例，約43.5萬人死於瘧疾。1其中約92%的死亡發生在撒哈拉以南地區。死亡率集中在幾個高危人群，包括孕婦和嬰兒。在非洲，每年有3300萬生活在瘧疾流行地區的婦女懷孕，其中35%在懷孕期間接觸瘧疾。瘧疾是由真核寄生蟲引起的瘧原蟲，並通過按蚊蚊子咬人。寄生蟲在人類宿主體內經曆一個複雜的發育周期。該周期的紅細胞內無性複製階段引起了疾病的症狀和嚴重程度。因此，瘧疾感染的嚴重程度因世界衛生組織的不同而不同瘧原蟲周效磺胺-乙胺嘧啶(惡性瘧原蟲而且間日瘧原蟲引起最嚴重的病例)，感染期間表達的寄生蟲變異和宿主免疫。事實上，在流行地區，個人在兒童時期獲得了保護性免疫，大多數成年人表現出這種疾病的少症狀或無症狀形式。另一方麵，最脆弱的人群是5歲以下兒童、不穩定傳播地區的個人(因此無法保持保護性免疫力)和孕婦。
妊娠期瘧疾(MiP)主要由惡性瘧原蟲．在懷孕期間，一個新器官的發育，胎盤，有利於特定的出現惡性瘧原蟲變異(VAR2CSA)，粘附在胎盤硫酸軟骨素A。2 - 4這種隔離損害了母體和胎兒之間的交換，並保護寄生蟲免受脾髒清除。2 5 6因此，MiP增加了孕產婦死亡、流產、死產和新生兒死亡的風險。2 7在季節性瘧疾傳播地區，孕婦患嚴重瘧疾的可能性是非孕婦的三倍。4 8
此外，MiP會導致母親和嬰兒的不良後果，特別是貧血和出生體重。4個92019年，共有82.2萬名低出生體重(LBW)新生兒與MiP有關。1據報道，在撒哈拉以南非洲，貧血約占所有孕產婦死亡的20%。10關於低體重體重的後果，約19%的嬰兒低體重體重是由瘧疾引起的，6%的嬰兒死亡是由瘧疾引起的低體重體重造成的。7LBW被認為是新生兒和嬰兒死亡的唯一最重要的危險因素。7此外，與MiP相關的LBW和貧血是兒童嬰兒期不良結果的預測因素。11 - 15號因此，MiP影響上一代和下一代，損害認知發展16也就是經濟生產力。
MiP的預防依賴於在妊娠中期和晚期係統地實施間歇性預防治療(IPT)，以減輕孕婦的寄生蟲負擔，1或者“篩查和治療”策略(發現和治療女性陽性病例)。IPT已證明其療效;然而，這一戰略是有代價的，因為經驗性使用抗瘧藥物會導致耐藥性，並可能導致副作用。17日此外，世衛組織估計，在產前保健期間，隻有62%的婦女至少接受過一次IPT, 34%的婦女至少接受過三次IPT。1在目前的IPT覆蓋率下，2020年估計避免了408000個LBWs，但IPT事件的影響仍然不足以減輕MiP負擔。此外，在懷孕的前三個月不可能使用IPT，因為磺胺類藥物是禁忌症，因為有神經管畸形的風險。混合策略也適用於某些設置(在妊娠前三個月進行篩查和治療，並從第24周開始進行IPTp21日22)．此外，篩查和治療策略受限於目前可用的診斷技術的敏感性。
瘧疾診斷依賴於用光學顯微鏡觀察染色的血液塗片來觀察寄生蟲。23日顯微鏡檢查師在紅細胞內鑒定寄生形態。在有經驗的人，檢測的極限約為50個寄生蟲/μL (p/μL)，23大多數設置為200 p/µL。顯微鏡的主要替代方法是快速診斷試驗(RDT)。RDT是一種抗原測試，在10-20分鍾內檢測患者血液中的寄生蛋白。
然而，顯微鏡和RDT的檢測限都相對較高(200 p/µL)，因此忽略了低水平感染。27重要的是，快速診斷診斷麵臨著寄生蟲“逃逸”的出現瘧原蟲RDT主要靶蛋白HRP-2缺失的菌株，28-31導致假陰性的檢測結果。在過去10年裏，基於分子的瘧疾診斷技術已成為敏感瘧疾檢測的一種替代方法。基於分子的技術或核酸檢測依賴於使用DNA和RNA聚合酶擴增和檢測特定的DNA或RNA序列。PCR和RT-PCR技術高度敏感(檢測限(LOD) <0.1 p/µL32)，但由於設備、試劑的要求以及樣品采集和診斷之間的延遲，對診斷不實用。因此，在目前的實踐中，這些技術僅用於流行病學調查和研究項目。等溫方法，如環介導等溫擴增(LAMP)，為使用分子技術診斷瘧疾提供了一種實用、快速和經濟高效的替代方法。
LAMP技術將分子方法的靈敏度提高到了現場水平。LAMP測試是一種核酸擴增方法，它依賴於一種鏈置換DNA聚合酶，它也保留逆轉錄酶的活性。該方法的原理是不需要對DNA模板進行變性，因此可以在等溫條件下進行LAMP反應。33它成本低，耗電少，見效快，可由受過最低限度培訓的衛生工作者進行。34研究發現LAMP具有與PCR相當的敏感性和特異性，且優於顯微鏡和RDTs。35LAMP是一種潛在的護理點檢測(POCT)，提供了顯微鏡和快速診斷的替代方案。36-38這是一種分子方法，與PCR相比，它更便宜、更簡單、更快，克服了PCR的三大缺點。該方法可檢出低至1 p/μL的寄生蟲血症，低於鏡檢或快速診斷檢測的檢出限。12日13
在我們小組以前進行的橫斷麵研究中，LAMP被證明具有更高的敏感性，與快速診斷和顯微鏡檢查相比，LAMP對有症狀的孕婦瘧疾的檢出率可提高30%。36 37此外，初步研究表明，在分娩結果方麵，使用LAMP主動檢測MiP和治療的好處。39
妊娠LAMP (LAMPREG)研究提出了一項實用的隨機診斷結果試驗，使用高靈敏度的LAMP技術來檢測更多無症狀的妊娠瘧原蟲孕婦感染。因此，可以及早治療懷孕母親，並可避免產婦和胎兒的發病率和死亡率。將通過確定母親和兒童的健康結果，特別是減少嬰兒貧血症和改善出生體重來衡量有意義的影響。這項研究在埃塞俄比亞特別重要，在那裏IPT不用於孕婦，因此，準確的篩查是至關重要的。
方法與分析
研究區域
這項研究將在埃塞俄比亞三個地區的衛生機構(衛生中心和醫院)進行。將在阿姆哈拉(Amhara)、甘貝拉(Gambella)和南方國家、民族和民族(SNNP)三個地區啟動六個研究地點。
研究設計
LAMPREG研究是一項前瞻性隨機診斷結果試驗。這項研究是加拿大阿爾伯塔省卡爾加裏大學和阿莫爾漢森研究所(AHRI)、吉馬大學和埃塞俄比亞阿姆哈拉公共衛生研究所的國際合作。
目的是確定:(1)與目前的一線吉姆薩染色顯微鏡診斷測試相比，LAMP提供了臨床可測量的益處，以及(2)加強對無症狀母親的LAMP病例檢測是否在結果方麵具有附加價值。有症狀和無症狀的孕早期和孕中期母親將被納入研究，並單獨隨機分配到兩個組中的一個:標準護理組(SOC)或使用瘧疾LAMP的增強病例檢測組。母親將在第一次產前檢查時登記，然後在產前檢查期間進行隨訪，直到分娩日，新生兒將在分娩後28天進行隨訪(表1)．
隨機分配到SOC組的母親將進行測試瘧原蟲根據埃塞俄比亞食品藥品和衛生保健管理和控製當局的規定，隻有當他們表現出至少以下瘧疾症狀之一時，才可以通過顯微鏡或RDT檢測感染:發燒、發冷、發冷、出汗、嚴重頭痛、全身和關節疼痛或蒼白。在幹預組中，除了RDT和鏡檢外，每次產前檢查時，無論是有症狀還是無症狀的母親，都將接受市售的經ce批準的LAMP瘧疾檢測(人類診斷LoopAMP(德國威斯巴登))。在幹預組中進行所有測試的目的是確定LAMP識別了多少額外病例。對隨機分配到雙臂的母親，將在每次ANC就診時測量血紅蛋白(Hgb)。將采集兩組患者的幹血點和等分的血液樣本進行儲存表1．
源人口
所有母親到甘貝拉、SNNP和Amhara地區的研究地點(保健中心或醫院)開始ANC隨訪。婦女的差旅費用得到補償，以提高對規程的遵守。
研究期間
納入從2021年7月開始，包括瘧疾季節性傳播地點的瘧疾高峰季節(9月至12月)。在瘧疾全年傳播的地點，可延長納入期，以達到目標樣本量。
研究人群
研究人群將包括符合以下納入標準的孕婦。
合格標準
妊娠初期或中期。
可以提供參與研究的同意書。
同意在產後28天回診所進行ANC隨訪、分娩和新生兒檢查。
年齡18歲及以上。
排除標準
抗瘧藥物攝入量(篩查日前3周內正在服用或有服用史)。
嚴重瘧疾的症狀和體征。
根據埃塞俄比亞衛生部的指導方針，標記為高危妊娠。40
嚴重貧血(Hgb為70g/L以下)。
超聲顯示多胎妊娠。
隨機過程
到ANC診所就診的孕婦將被隨機分配到SOC組或幹預組，使用REDCap電子數據捕獲係統8.11.5版本(https://www.project-redcap.org/)，並由AHRI管理。此外，隨機分組將按胎次進行分層，因為第一次懷孕的婦女患胎盤瘧疾的風險更高，而且以前在懷孕期間接觸過特定的寄生蟲變異可能具有保護作用。3 41 42參與者由數據管理人員隨機抽取，並由每個研究地點的研究護士和醫務人員登記。
變量
主要的結果
新生兒LBW (<2500 g)的比例。
次要結果(因變量)
實際出生體重(克)。
小於胎齡(出生體重低於10百分位)。
孕婦妊娠期和分娩時的Hgb。
胎兒血紅蛋白。
胎兒丟失(死產、流產、流產)。
早產(妊娠<37周)。
新生兒死亡。
的跡象瘧原蟲感染:當前(胎盤血液中存在無性寄生蟲)或過去感染(胎盤血液中存在瘧疾色素)。
還將分析這些變量的綜合結果。
其他端點
對比qRT-PCR(金標準)的敏感性、特異性、陽性和陰性預測值，評價LAMP、RDT和鏡檢的性能。的跡象瘧原蟲目前的感染(胎盤血液中存在無性寄生蟲)或過去的感染(胎盤血液中存在瘧疾色素)將通過胎盤血液塗片進行評估。
待分析的子組
治療意向（ITT公司):均為隨機研究對象。這將被認為是分析的主要人群。
每一個協議（頁):所有完成整個研究期的隨機研究對象(完整病例)。對於特定的分析，缺少模型中任何變量數據的研究對象將被排除在分析之外。對該總體的分析被視為敏感性分析，以調查結論是否對缺失數據模式的假設敏感。
以下亞組(ITT和PP種群)將被獨立分析:
初次分娩的母親。
無症狀瘧疾:在ANC就診時未出現症狀但檢測為陽性的婦女瘧原蟲任何診斷方法的SPP感染。
亞顯微瘧疾:僅通過分子方法(LAMP或事後金標準RT-qPCR)診斷為瘧疾陽性的任何婦女。
已確定的瘧疾種類:惡性瘧原蟲，間日瘧原蟲混合感染(三個亞組)。
分娩時胎盤血液瘧疾檢測呈陽性的婦女。
分娩低體重新生兒的婦女。
樣本大小
本研究的樣本量計算基於檢測LBW分娩比例的差異，LBW被認為是臨床最重要的結局變量。在埃塞俄比亞，低體重分娩的患病率估計為17.3%。alpha值為0.05，分配比例為3:1，有利於增強的病例檢測部門，以最大限度地提高幹預的影響。該研究將被用於檢測LBW為5%的分娩比例的絕對差異，因此增強病例檢測組的比例為12.3%，而SOC組的比例為17.3%。使用連續性校正和20%的損耗率，總樣本量為2583，以達到80%的功率。
數據收集和實驗室方法
社會人口學和臨床數據
將使用統一的病例報告表格收集社會人口學特征和臨床數據(從病史和體檢中獲得)。
臨床檢查
納入時，由訓練有素的醫務人員進行便攜式產科超聲檢查，以評估胎齡(Clarius C3, Clarius，加拿大)。在每次就診時，使用保健中心提供的標準秤記錄婦女的身高和體重。新生兒體重記錄在從頭到腳評估期間，分娩時和第一次喂養前。衛生中心實施了專門用於這項研究的數字秤，以確保統一測量新生兒體重。
實驗室程序
在每次產前檢查時收集所有納入婦女的全血。鏡檢程序按照衛生部的建議進行，使用10%吉氏塗片，鏡檢師將檢查8000個白細胞，然後判斷玻片為陰性。所使用的快速診斷將是在物種水平上檢測瘧疾的Core Pan/Pf/Pv。所有商業測試均根據相應製造商的說明進行。在保健中心使用POCT Hgb設備(HumaMeter (HumanDE，德國)和HemoCue (HemoCue，瑞典))直接測量孕產婦和新生兒血紅蛋白含量。本研究使用的LAMP測試為HumaLoop (Pan, Pf, Pv, HumaLoop Eiken, Japan)。“Pan”測試(檢測所有瘧原蟲首先執行Spp)，然後進行物種水平測試(如果是陽性)。為了保證質量，每項測試都包括陽性和陰性對照。
分娩時，將從胎盤的母體一側采集胎盤血。將對胎盤血進行顯微鏡檢查，以評估瘧疾色素的存在。表1總結每次研究訪問的程序。重要的是，胎盤血液將被保存下來，用於使用LAMP技術和參考技術進行瘧疾篩查。保存的血液將使用金標準技術進行處理，以評估研究人群中瘧疾的真實負擔。
數據管理
原始數據將輸入REDCap電子數據采集係統8.11.5版本(https://www.project-redcap.org/)，並由AHRI管理。開發了數據輸入和數據管理程序，隻有授權用戶才能訪問數據庫。數據輸入程序由數據管理員驗證，由主要研究員負責。
統計分析方案
使用SISA在線統計軟件確定敏感性、特異性、預測值和kappa係數。我們將使用STATA V.15, SPSS 28.0.1.1和R包hreport進行數據解釋。將計算顯微鏡和LAMP與PCR金標準的敏感性、特異性和預測值。將使用單變量二項回歸確定流行病學變量和瘧疾陽性的統計分析。在初步分析中發現具有統計學意義的變量將通過多元回歸分析進行特征描述。將計算幹預與SOC組主要結局變量的風險比。亞組分析將對潛在的混雜因素進行分析，並在幹預組通過LAMP和鏡檢比較陽性。中期分析計劃達到納入目標的25%和完成目標的25%。終止試驗的最終決定由首席研究員作出。完整的統計分析計劃將上傳至試用注冊中心。
患者和公眾參與
沒有病人參與。
倫理與傳播
道德
該研究由以下倫理研究委員會批準:AHRI/ALERT倫理審查委員會(FORM AF-10-015.1，協議號PO/05/20)，埃塞俄比亞科學和高等教育部國家研究倫理審查委員會(批準SRA/11.7/7115/20)，埃塞俄比亞食品和藥物管理局(批準02/25/33/I)， UCalgary聯合健康研究倫理委員會(REB21-0234)。這些批準須符合適當的研究行為，並將每年更新，直至研究完成。議定書修正案將提交倫理研究委員會。在研究設計期間，孕婦的安全是優先考慮的，包括對陽性婦女治療後的嚴重不良事件監測。研究納入程序旨在通過在程序中使用獨立於研究人員的第三人作為證人來保護不識字的婦女。所有研究人員將接受良好臨床規範- ich6的培訓。在研究過程中收集的個人信息在主要研究者的負責下被鎖在櫃子裏。下遊分析隻使用研究數據。
傳播
研究結果將通過包括教師、學生和工作人員在內的當地座談會與所有調查人員及其機構共享。研究結果將與利益攸關方分享，如埃塞俄比亞衛生部、創新診斷基金會、世衛組織瘧疾多邊倡議-熱帶病研究、遏製瘧疾和MiP聯盟。研究結果還將發表在同行評議的期刊上，並在國際會議上發表。值得注意的是，研究結果將總結成小冊子，並通過實地推廣工作者在社區傳播。
討論
2019年，3300萬婦女麵臨MiP風險。MiP影響新生兒健康和妊娠結局，包括出生體重、流產和死產。2 43此外，對受感染母親所生的兒童也有長期影響，包括更容易感染嚴重瘧疾和傳染病。2 15 16此外，MiP損害神經發育和認知發育。
出現多重耐藥瘧原蟲這種毒株威脅到目前基於IPT的MiP預防戰略。重要的是，IPT不包括懷孕的前三個月，而懷孕前和前三個月的感染會影響分娩結果。
LAMPREG旨在衡量埃塞俄比亞兩個地區參加ANC的孕婦主動發現瘧疾病例的影響。此外，LAMPREG將測量主動檢測的婦女的分娩結果瘧原蟲感染與SOC比較。值得注意的是，在LAMPREG期間保存的樣品將被評估後驗對於實際的負擔瘧原蟲研究人群中的感染和可能影響出生結果的寄生變異的存在。
我們估計LAMPREG的影響是相當大的。LAMP技術和其他分子診斷工具為遠程衛生中心提供高靈敏度檢測的能力有可能成為預防MiP的轉折點。
倫理語句
患者發表同意書
致謝
我們感謝HUMAN Gesellschaft für Biochemica und Diagnostica mbH的工作人員對這項研究的後勤支持。
參考文獻
腳注
推特@LabPillai
RFG和CK貢獻相當。
合作者LAMPREG研究小組:Filmona Mekuria, Getaneh Alemu, Beka Raya, Omar Abdullah, Taye Teka, James Cheaveau, Ruth Legese, Hiwot Asmerom, Ermias Hundito, Ebrahim Nursefa, Hiwot Tilahun, Jack伯克-加夫尼，Lisa Oberding, Deneke Zewdu, Pawulos Kassaw, Sintayehu Ejeta, Samuel Ayele。
貢獻者RFG和CK起草了手稿。RFG、CK、ZMB、MT、BT、DY、AGB、DRP對稿件進行了修改。AGB和DRP設計了這項研究。RFG、ZMB、BT和DY組織了實地研究。RFG、ZMB、MT、BT、DY和AGB進行了實地研究。RFG、ZMB、BT、DY為研究合作者。DRP、AGB和MT為研究調查者。DRP是主要研究者，構思了這項研究並獲得了資金。LAMPREG小組的所有成員都對研究的概念、設計或組織做出了重大貢獻。所有作者都批準了最終版本。
資金這項工作得到了加拿大大挑戰基金會(資助號TSS-2004-32152)、創新診斷基金會(資助號eRSO 1054180)和加拿大阿爾伯塔省卡爾加裏大學副校長研究辦公室的支持。卡爾加裏大學和埃塞俄比亞亞的斯亞貝巴的阿莫爾·漢森研究所都通過直接財政支持和實物捐助支持了這項研究。
相互競爭的利益沒有宣布。
患者和公眾參與患者和/或公眾沒有參與本研究的設計、實施、報告或傳播計劃。
出處和同行評審不是委托;外部同行評審。