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摘要
目標糖皮質激素(GC)水平的快速變化和腎上腺功能不全與心髒驟停(CA)綜合征的發生有關。然而，GC受體(GR)的表達變化尚未被研究。因此，本研究旨在探討CA患者GR表達的早期變化與預後和免疫反應的關係。
設計前瞻性觀察研究。
設置急診科。
參與者2018年10月至2019年10月收治CA術後自發循環(ROSC)恢複早期患者(85例)。在體檢後，選取年齡和性別相匹配的健康個體(40名)作為對照組。
主要和次要結果測量評估循環T和B淋巴細胞、自然殺傷細胞和調節性T (Treg)細胞GR表達和細胞計數。同時也檢測了血漿總皮質醇和腎上腺皮質激素(ACTH)水平。
結果與健康對照組相比，CA患者的所有細胞計數均較低，血漿總皮質醇水平較高(p<0.001)。GR在Treg細胞和CD3中的表達+CD4+CA組T淋巴細胞無顯著性差異，但其他細胞的平均熒光強度和GR表達均低於健康對照組(p<0.05)。ACTH水平沒有差異。幸存者和非幸存者之間沒有顯著差異。
結論本研究顯示，在經曆CA的患者中，ROSC後早期GR表達和細胞計數迅速下降，而血漿總皮質醇水平升高。我們的研究結果為這些患者的GR水平和功能以及免疫抑製狀態提供了重要信息。評估發生過CA的患者中GR的表達可能有助於篩選那些對GC治療更敏感的患者。
- 事故與急診醫學
- 重症和危重護理
- 成人重症監護
數據可用性聲明
所有與研究相關的數據都包含在文章中或作為補充信息上傳。不適用。
這是一篇開放獲取的文章，按照創作共用署名非商業性(CC BY-NC 4.0)許可發布，該許可允許其他人以非商業性的方式發布、混編、改編、構建本作品，並以不同的條款授權他們的衍生作品，前提是原創作品被正確引用，給予適當的榮譽，任何更改都被注明，且使用是非商業性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/．
來自Altmetric.com的統計
本研究的優勢和局限性
本研究設計為單中心前瞻性研究。
這是第一項評估心髒驟停(CA)患者自發循環(ROSC)恢複早期糖皮質激素受體(GR)表達的研究。
我們隻研究了ROSC後早期發生CA的患者GR的表達;因此，我們的結果不能外推到24小時以上的時間點。
GR表達的降低可能會影響CA患者對糖皮質激素的敏感性。
GR表達減少可能影響發生CA患者的潛在免疫後果。
簡介
心髒驟停(CA)是一個全球性的重大健康問題;在美國，每年約有355.6萬人因急性冠脈綜合征而經曆醫療急救，而在中國，每年有超過54.4萬人死於突發冠脈綜合征。1 2經曆過CA的患者的全身缺血-再灌注反應可表現為心髒驟停後綜合征(postcardiac stop syndrome, PCAS)或全身炎症反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)，增加多器官衰竭和感染的風險，影響患者自主循環恢複(ROSC)後的炎症反應和預後。3 - 6
CA是急性應激事件中最強烈的，嚴重影響垂體和腎上腺軸功能。7研究表明，CA患者ROSC後皮質醇水平異常和相對腎上腺皮質功能不全與預後相關。8 - 11然而，糖皮質激素(gc)的臨床應用仍存在爭議。2015年國際心肺複蘇指南中，不建議在院內或院外CA患者的複蘇中常規使用gc。12近期臨床研究表明，CA術後早期應用皮質類固醇可改善ROSC的成功率、神經係統功能結局及預後，推測與其對血流動力學的影響、SIRS反應等機製有關。12 - 17因此，GCs在PCAS發生和發展中的作用有待進一步研究。
GCs與細胞內GC受體(GRs)結合，發揮抗炎和免疫抑製作用，減少炎症細胞因子的產生和釋放。18 19獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)患者循環單核細胞中GRs與GCs的親和力降低。20.危重症患者外周血多形核細胞中GR α和β的表達降低，21兒科感染性休克，血清皮質醇水平高。22但尚未有研究報道CA患者ROSC後GR的表達。既往研究發現循環B、T淋巴細胞、調節性T (Treg)細胞和單核細胞的數量以及循環單核細胞和B、T淋巴細胞上人白細胞抗原DR的表達減少。23日24因此，本研究旨在通過觀察循環T、B淋巴細胞、自然殺傷(NK)細胞和Treg細胞中GR的表達及其細胞計數、血漿總皮質醇和腎上腺皮質激素(ACTH)水平，探討GR表達與CA患者ROSC後早期免疫改變的關係。
材料和方法
研究參與者
這是一項在急診科進行的觀察性研究。根據2015年國際心肺複蘇指南，25我們招募了CA後早期ROSC期的患者(包括院內和院外CA)，並在2018年10月至2019年10月期間入住急診科。納入標準為ROSC後6和<24小時CA >，格拉斯哥昏迷評分(GCS) <8的患者。排除標準為(a)年齡<18歲，(b)疾病終末期(如任何類型的癌症、艾滋病)，(c)過去3個月內接受皮質類固醇治療，(d)使用皮質類固醇，(e)腎上腺功能不全。所有患者均按照2015年國際心肺複蘇共識進行治療。13在體檢後，招募年齡和性別匹配的健康個體作為對照組。
數據收集
根據2004年Utstein Style模板指南進行數據收集。26我們收集了人口學數據、複蘇(初始心律、ROSC時間和累積腎上腺素(腎上腺素)劑量，以及ROSC後6小時和<24小時進行的常規血細胞計數、血氣分析和血液生化測試的實驗室結果。急性生理和慢性健康評估(APACHE) II和順序器官衰竭評估(SOFA)用於確定疾病的嚴重程度。采集晨間臨床常規檢查或身體健康檢查的殘血樣本，運輸和儲存過程中保持4℃，用於測定循環T、B淋巴細胞、NK細胞和Treg細胞中GR的表達及細胞計數。血漿在儲存期間保持在- 80°C，並用於測定總皮質醇和ACTH水平。隨訪期間，收集28天生存數據。在線補充圖1展示了本研究的工作流程。
結果測量
本研究的主要結果是GR表達和T、B細胞、NK細胞和Treg細胞計數，用流式細胞術測定。靜脈采血於乙二胺四乙酸管中，測定GR在T、B淋巴細胞、NK細胞和Treg細胞中的表達。簡單地說，100 μ L的外周血樣本在黑暗處用表麵抗體(CD3, CD4, CD8, CD19, CD16, CD56, CD25和CD127)染色20分鍾。紅細胞溶解15分鍾，然後衝洗掉碎屑。在染色細胞內GR抗體及其同型對照(Bio-Rad AbD sertec, Oxford, UK)之前，使用BD轉錄因子緩衝集(BD Pharmingen, San Diego, USA, catalog No. 562574)對表麵染色的細胞進行固定和滲透。單克隆抗體及其同型對照均購自BD Biosciences (San Jose, California, USA)。所有抗體的細節見在線補充表1．根據生產廠家的建議，所有抗體及其同型對照以每100µL全血1µL的濃度使用。使用加利奧斯流式細胞儀(Beckman Coulter, Brea, California, USA)測量樣品，並使用加利奧斯軟件V.1.0 (Beckman Coulter)進行分析。由工程師定期校準流式細胞儀。細胞染色20分鍾;使用製造商推薦的同型對照定義閾值。單樣本的代表性圖和門控策略顯示在在線補充圖2．T細胞被CD3門控+CD4+或CD3+CD8+， B細胞被CD3門控−CD19+， NK細胞被CD16門控+CD56+treg由CD4門控+CD25高CD127低．每個樣本在淋巴細胞細胞門中至少收集了10000個事件。結果以百分比和平均熒光強度(MFI)值表示。
絕對CD3+和CD4+淋巴細胞、NK細胞和Treg細胞計數使用流式計數熒光球(Beckman Coulter，目錄編號7547053)，根據製造商說明進行。B, CD3+CD4+T, CD3+CD8+T和Treg細胞計數按其在CD3中的百分比計算+或CD4+淋巴細胞乘以CD3+或CD4+淋巴細胞計數。
本研究的次要結果是ROSC後血漿總皮質醇和ACTH水平。靜脈血標本取於肝素抗凝管中，3000rpm離心10min， - 80℃保存。在西門子自動化分析儀(IMMULITE 2000 XPi;西門子醫療保健診斷，Erlangen，德國)。設備和試劑在使用前由工程師校準。總皮質醇檢出下限為2.00 ng/mL, ACTH檢出下限為5.00 pg/mL。
樣本量計算與統計分析
采用PASS V.15.0軟件(NCSS, LLC, Kaysville, Utah, USA)和非參數檢驗方法計算樣本量。健康組和CA組GR表達中位數分別為0.93和0.80，四分位間距分別為0.1和0.3。按照兩組1:2的比例，檢驗水平為0.05,CI為0.90，總共需要105份樣本，其中健康組至少35份，CA組至少70份。本研究的兩組人數分別為40人和85人，符合我們的研究要求。數據分析使用SPSS V.22.0 (IBM公司，Armonk, New York, USA)。對於正態分布數據，連續變量用標準差表示為均值。由於總皮質醇和ACTH水平的數據存在傾斜分布，我們將結果與加1 (ln(總皮質醇+1)，ln (ACTH+1))後的自然對數轉換值進行了比較。具有傾斜分布的測量數據表示為中位數(第25和第75百分位)。采用Mann-Whitney U檢驗比較組間變量。使用2×2列聯表中的定性參數進行分析。 All statistical tests were two-tailed, and a p value of <0.05 was considered statistically significant.
後續
根據28天生存終點將患者分為存活組和非存活組。隨訪期間出現全因死亡的患者被認為是非幸存者。如果數據丟失，則排除相應的候選項。
患者和公眾的參與
患者和/或公眾未參與本研究的設計、實施、報告或傳播計劃。
結果
病人的特點
對40名健康個體和85名患有CA的患者進行了分析。兩組的人口統計學和臨床特征見表1．在本研究中，急性心髒和腦事件是CA的主要原因，後一類事件源於中風。CA的其他原因包括中毒(包括一氧化碳中毒)和低鉀血症。CA組與健康對照組的性別、年齡差異無統計學意義。存活組與非存活組基於28天生存的臨床特征比較見在線補充表2．CA組與健康對照組的APACHE II和SOFA評分差異有統計學意義(p均<0.001)，存活組與非存活組差異有統計學意義(p分別<0.001和p=0.011)。
ROSC後循環T、B淋巴細胞、NK細胞和Treg細胞計數的變化
CA患者ROSC後T、B淋巴細胞、NK細胞和Treg細胞計數均顯著低於健康對照組(p均<0.001)。此外,CD3+CD4+/ T淋巴細胞、CD3+CD8+/T淋巴細胞和Treg細胞/CD4+經曆過CA的患者在ROSC後T淋巴細胞比率顯著低於健康對照組(p<0.001) (圖1；在線補充表3)．然而，存活者(n=20)和非存活者(n=65)在這些細胞計數和比率方麵沒有顯著差異(p>0.05) (在線補充表4)．
循環T和B淋巴細胞、NK細胞和Treg細胞計數、CD3的變化+CD4+/ T, CD3+CD8+/ T和Treg / CD4細胞+健康對照組與CA組T淋巴細胞比值比較。CA組與健康對照組比較差異有統計學意義(p<0.001)。CA,心髒驟停;CD, Cluster-of-Differentiation;NK,自然殺傷細胞;Treg，調節性T細胞。
GR在ROSC後循環T、B淋巴細胞、NK細胞和Treg細胞中的表達
GR在B、T淋巴細胞、NK細胞和CD3中的表達比例及MFI+CD8+CA患者ROSC後T淋巴細胞明顯低於健康人(均p<0.01) (圖2A-D, G, H, K和L)．Treg細胞和CD3中的MFI也明顯減少+CD4+T淋巴細胞(p均<0.05)(圖2 e,我)，但GR表達的百分比沒有變化(p>均為0.05)(圖2F和J；在線補充表5)．然而，存活者和非存活者在這些細胞中的MFI和GR表達百分比沒有顯著差異(p>0.05) (在線補充表6)．
健康對照組和CA組循環T、B淋巴細胞、NK細胞和Treg細胞中GRs的表達CA組與健康對照組比較差異有統計學意義(p<0.05)。CA,心髒驟停;CD, Cluster-of-Differentiation;GR,糖皮質激素受體;NK,自然殺傷細胞;ROSC，自發循環恢複;Treg，調節性T細胞。
ROSC後血漿總皮質醇和促腎上腺皮質激素水平的變化
我們測量了40名健康個體和85名患有CA的患者的血漿總皮質醇和ACTH水平(由於沒有測量他們的總皮質醇水平，兩個樣本被排除在外)。CA患者的血漿總皮質醇水平顯著高於健康對照組(p<0.001)，但ACTH水平沒有(p<0.001)。圖3A及C)．存活者與非存活者之間的ln(總皮質醇+1)和ln (ACTH+1)值無顯著差異(p均為0.05)(圖3B及D)．
(A, C)健康對照組和CA組ROSC後血漿總皮質醇和ACTH水平(加1後的自然對數轉換值)。(B, D) ROSC後幸存者和非幸存者的血漿總皮質醇和ACTH水平。CA組與健康對照組比較差異有統計學意義(p<0.05)。促腎上腺皮質激素促腎上腺皮質的;CA,心髒驟停;ROSC，自發循環的恢複。
討論
在本研究中，我們檢測了ROSC後早期發生CA的患者GR表達水平和血漿皮質激素水平。我們發現CA患者循環T、B淋巴細胞、NK細胞和Treg細胞中GR的表達、細胞計數和比例均明顯低於對照組。此外，CA患者的血漿總皮質醇水平明顯高於對照組。
缺血再灌注反應引發急性炎症反應，導致心髒驟停後複蘇休克。27經曆CA的患者免疫反應受損，全身炎症反應增加。6 28T、B淋巴細胞、NK細胞、Treg細胞計數及CD3+CD4+/ T, CD3+CD8+/T和Treg細胞/CD4+ROSC後T淋巴細胞比值明顯降低。NK細胞是一種特殊的先天免疫細胞，具有類似CD3的細胞毒性功能+CD8+T淋巴細胞，主要區分感染和應激細胞與健康細胞，清除細胞內感染和功能障礙細胞。29 30T淋巴細胞也至關重要，因為它們作為適應性免疫細胞控製和消除感染。29此外，B和T淋巴細胞分別介導體液免疫和細胞免疫。本研究進行得較早，對CA患者的免疫係統進行了更全麵的評估。與以往的報道相比，我們的研究結果更有力地支持這些患者在ROSC後迅速出現免疫功能障礙。
在不同的外周血單個核細胞中，GCs與GR的結合導致細胞調節凋亡、增殖和活性的能力發生變化，GC-GR複合物限製炎症基因的轉錄(反式抑製)，包括那些編碼促炎細胞因子的基因。31日32本研究首次探討了ROSC後CA患者循環免疫細胞中GR的表達。觀察GR在B、T淋巴細胞、NK細胞和CD3中的表達+CD8+CA患者T淋巴細胞顯著降低，GR患者T淋巴細胞顯著降低+Treg細胞和CD3+CD4+T淋巴細胞略有下降。此外，我們觀察到Treg細胞和CD3中GR表達的MFI更顯著下降+CD4+T淋巴細胞中GR的表達百分比不高。先前的研究發現，危重患者外周血多形核細胞中GRs的表達減少，21拮抗GRs會加重病毒和細菌感染。33感染誘導的GCs有助於維持體內平衡，減輕敗血症對宿主的威脅生命的影響。31盡管有研究報道在心肺複蘇(CPR)期間和之後使用gc似乎對ROSC率和長期生存率有好處，但證據不足。13 18 34 35由於皮質醇信號是由GRs介導的，我們假設發生CA的患者對GC的不同反應可能與GR表達水平有關。本研究提示，CA患者細胞內GR表達減少，是由於GRs與GCs結合不足，GC不敏感，GCs不能有效發揮抗炎和免疫抑製作用，導致GC耐藥的原因之一。這些發現也可以解釋為什麼先前關於GCs臨床應用的報道有不同的結果。此外，測量GR水平是至關重要的，因為GR的充分表達對於在心肺複蘇期間和之後調節足夠的GC效應至關重要。
我們還發現，發生CA的患者血漿總皮質醇水平顯著升高，但ACTH水平沒有升高。高水平的炎症細胞因子抑製ACTH的釋放。18在病危期間，身體無法充分代謝皮質醇。36此外，血漿皮質醇水平的持續升高可能觸發下丘腦-垂體-腎上腺軸的負反饋通路，抑製ACTH和皮質醇的釋放，最終導致腎上腺功能不全。37這些因素可能解釋了本研究納入的CA患者血漿ACTH和皮質醇水平的相反趨勢。值得注意的是，這一結果表明，CA患者血漿總皮質醇水平高與GR低表達水平不匹配。GR低表達與皮質醇高表達之間的分離暗示了一種異常的應激反應。38先前的研究已經報道了gr -作用在整個危重疾病中明顯被抑製;GR阻力不能通過進一步增加GC可用性來克服。21 39 40正常GC功能也需要足夠的GR水平和功能，這可能解釋了發生CA的患者對外源性類固醇給藥或內源性皮質醇分泌的反應性差異。因此，實際GR水平不能僅通過測量總皮質醇水平來反映。因此，在應用個性化GC治療時應考慮GR水平。GR表達的測定可能有助於篩選對GC處方反應較好的患者。
限製
我們的研究有幾個局限性。首先，為了評估變化，我們隻招募了經曆過CA並有全身性缺血缺氧體征的患者，如ROSC後GCS <8。這些患者沒有按年齡、性別、合並症的發生情況或輕度係統性缺血缺氧進行分層。其次，由於這是一個初步的觀察性研究，我們隻觀察到早期的變化。更相關的對照組和更長時間的動態觀察將有助於理解GR表達在ROSC後CA臨床過程中免疫進化的意義。第三，本研究使用的樣本來自臨床實驗室;因此，在我們采集樣本之前，樣本中的血漿總皮質醇和ACTH存在降解的風險。最後，我們沒有討論GR亞型、遊離皮質醇和皮質類固醇結合球蛋白的變化及其作用。因此，為了更好地了解ROSC在CA患者中的免疫抑製作用，有必要對這些方麵進行進一步的研究。
總之，本研究顯示，在發生CA的患者中，ROSC後早期GR表達、細胞計數和比例迅速下降，而血漿總皮質醇水平升高。這些發現可能為這些患者GR表達水平、功能和免疫抑製狀態提供重要信息。
數據可用性聲明
所有與研究相關的數據都包含在文章中或作為補充信息上傳。不適用。
倫理語句
病人同意發表
倫理批準
本研究經北京朝陽醫院醫學倫理委員會批準。倫理名稱ID為2013-KE-1。參與者在參與研究前給予知情同意。
致謝
我們感謝所有參與這項研究的患者及其家屬，以及提供支持的急診科同事。我們感謝醫院工作人員為搶救病人所做的努力。
參考文獻
補充材料
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補充數據
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腳注
貢獻者CL是擔保人。CL設計了這項研究並審閱了手稿。YY檢索文獻，參與實驗研究、數據分析和稿件撰寫。ZT, C-CH和LA收集和分析數據。JL和MX幫助進行統計分析。所有作者已閱讀並認可最終稿。
資金作者們還沒有從任何公共、商業或非營利部門的資助機構為這項研究宣布具體的資助。
相互競爭的利益沒有宣布。
患者和公眾的參與患者和/或公眾未參與本研究的設計、實施、報告或傳播計劃。
來源和同行評審不是委托;外部同行評議。
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