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目標比較免疫組織化學(包含IHC)表皮生長因子受體(EGFR)的表達與口腔鱗狀細胞癌(OSCC)基因擴增評估通過熒光原位雜交(FISH)和顯色原位雜交(CISH)及其與臨床病理參數。此外,我們檢測的敏感性和特異性CISH相比,魚。
設計病例係列研究
設置口腔手術和病理部門牙科學院。
參與者52例OSCC組織病理學診斷。
方法從52例OSCC患者腫瘤組織樣本評估包含IHC,魚和CISH使用組織微陣列技術。所有患者臨床病理的數據收集。
結果表皮生長因子受體由包含IHC +利率分別為53.8%(28/52),5.8%(3/52)由魚CISH和15.4% (8/52)。放大檢測到CISH和魚包含IHC -發生在3.8%(2/52),1例(1.9%)顯示,放大檢測到CISH和魚和蛋白質過度相符。有魚+ 9.6%情況下包含IHC CISH負率和6/8(75%)魚+以及EGFR +案例;然而,蛋白表達與基因擴增技術文件不存在。包含IHC和魚率並不與臨床病理的特點有關。CISH +利率與T3-T4狀態有關。與魚試驗相比,CISH達到敏感性為37.5%,特異性為100%。
結論之間沒有協會EGFR表達和基因擴增在OSCC IHC外部驅動蛋白的抗原表位。盡管CISH表明特異性,技術問題可能影響感性與魚相比。
- 口腔醫學
- 組織病理學
- 表皮生長因子受體
- 口腔鱗狀細胞癌
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文章總結
文章重點
本研究比較免疫組織化學,顯色原位雜交(CISH)和熒光原位雜交(FISH)評價的表皮生長因子受體(EGFR)在口腔鱗狀細胞癌(OSCC)。這表明這些方法之間沒有關聯,並討論它們的局限性。
作者表明,其他機製,改變蛋白表達,與放大,在OSCC需要調查。
關鍵信息
之間沒有協會EGFR表達和基因擴增在OSCC免疫組織化學外部驅動蛋白的抗原表位。
雖然在這些樣本CISH表明特異性,技術問題可能影響感性與魚相比。
本研究的優點和局限性
本研究的力量是表皮生長因子受體的三種標準化方法之間的比較調查。這個信號是成為有吸引力的頭頸部鱗狀細胞癌的治療。
應該考慮以下限製:preanalytical因素可能影響CISH的信號強度。
介紹
表皮生長因子受體(EGFR)信號參與調控細胞增殖和分化在開發過程中,在腫瘤細胞中,形成有利於增殖、浸潤和轉移。1,2它經常表現在許多類型的癌症包括頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)。作為其過度經常與臨床療效不佳有關,受體在腫瘤的治療變得有吸引力。3,4
通過免疫組織化學方法比較研究表皮生長因子受體檢測(包含IHC)和熒光原位雜交(FISH)顯示和合率很高。顯色原位雜交(CISH)幾年前推出替代魚的一些優點,如評價傳統的亮場顯微鏡係統,永久保存記錄和形態學特征。5,6然而,迄今為止,沒有研究已經出版關於EGFR拷貝數檢測到魚伴隨CISH和蛋白表達的評估口腔鱗狀細胞癌(OSCC)。
本研究的目的是調查的形象表達EGFR蛋白和關聯這一發現基因狀態評估的兩種方法雜交(CISH和魚)在OSCC的腫瘤樣本。臨床病理的參數也被包括在評估腫瘤。此外,CISH一直與魚的準確性。
材料和方法
病人的資格
組織病理學診斷的OSCC患者加入這項研究。臨床資料,如年齡、性別、症狀、腫瘤的位置和延伸,節點參與和煙草和酒精的習慣,獲得來自醫療記錄。腫瘤樣本從切口活檢獲得之前任何輔助治療。
本研究經當地研究倫理委員會批準和簽署知情同意是獲得所有的參與者。
免疫組織化學(包含IHC)
包含IHC檢測表皮生長因子受體的抗原進行使用單克隆抗體克隆31日七國集團(g7)(酶實驗室公司,舊金山,加利福尼亞,美國)和部分口腔黏膜被用作積極控製。短暫4μm部分鍍在組織學幻燈片3-aminopropyltriethoxy-silano處理,其次是deparaffination、水化和阻塞的內在酶活性。幻燈片當時沉浸在胃蛋白酶10% 37°C。在蒸餾水洗滌後,部分隨後被孵化的主要抗體(1:10 0稀釋)在室溫下60分鍾。衝洗後Tri-HCl緩衝區,部分被孵化30分鍾在室溫下與生物素化的多鏈路豬antigoat,老鼠和兔子免疫球蛋白(LSAB工具包,DaKo Carpinteria,加利福尼亞,美國)。反應是揭示了通過應用3,3 ' -diaminobenzidine(塗)色原溶液中(Dako;美國加利佛尼亞Carpinteria)。與邁耶的蘇木精複染色的部分和安裝在Permount(費舍爾科學;美國新澤西州)。半定量的評估免疫組織化學染色結果由一個病理學家不知道臨床病理的細節和基因擴增的地位。 EGFR expression was evaluated according to a previously defined four-point scale based on the immunolabelling of tumour cell membranes proposed by Diniz-Freitas等7如下:0(無標簽或標簽< 10%的腫瘤細胞);(1)(弱標簽,均勻或片狀> 10%的腫瘤細胞);(2)(溫和的標簽,均勻或片狀> 10%的腫瘤細胞);(3)(強烈的標簽,均勻或片狀> 10%的腫瘤細胞)。這些分數隨後被分為兩類:消極(0或1)和積極的標簽(2或3)。
組織微陣列(TMA)
代表的核心組織部分強烈immunoexpression EGFR被從石蠟塊每個病人和安排在一個新的組織微陣列(TMA)塊使用手冊組織陣列(美國馬裏蘭州比徹儀器,銀泉)。蒙泰羅先前提出的等8,我們選擇感興趣的區域,避免壞死和角蛋白池。在消極的情況下,一個代表區域的腫瘤組織學畢業選擇的考慮。一個核心從每個示例使用1毫米直徑。為了執行魚和CISH化驗,4µm厚部分。
熒光原位雜交(FISH)
Zytolight規範EGFR /岑7雙顏色探針(Zytovision、不來梅港、德國)是用來執行的魚。deparaffinisation後兩個100%二甲苯的衝洗5分鍾,幻燈片是患者通過兩個100%的酒精衝洗5分鍾。接下來,下滑是0.2更易/ l鹽酸處理20分鍾,蒸餾水為2分鍾和2×標準檸檬酸鹽3分鍾。下滑是提交給預處理緩衝區(Saline-sodium檸檬酸(SSC)緩衝區:0.3 l更易與氯化鈉和0.03更易與l檸檬酸鈉)30分鍾在82°C水浴然後36分鍾37°C的蛋白酶消化蛋白酶緩衝區(0.01 0.05更易/ l Tris-HCl pH7.8,更易與l酸乙二胺tetra-acetic和0.01更易與l氯化鈉)。最後,幻燈片放在10%福爾馬林在磷酸鹽(PBS) 10分鍾。脫水進行了70年,85年和100%的乙醇,連續。魚DNA探針和目標都是同時變性5分鍾在75°C和孵化一夜之間在37°C。信號檢測的下滑是放在posthybridization洗緩衝區(SSC和NP40) 3分鍾在74°C和複染色2×SSC / 0.03µg /毫升4,6-diaminido-2-phenylindole鹽酸鹽的細胞核的識別。
顯色原位雜交(CISH)
CISH進行4µm-thick formalin-fixed,石蠟包埋腫瘤樣本。簡單,組織在二甲苯deparaffinised和沉浸在乙醇和後來在CISH組織熱預處理方案(美國加州英傑公司公司,貝)在98°C 21分鍾。幻燈片立即用蒸餾水洗了2分鍾。酶消化係統是由胃蛋白酶10分鍾內孵化部分在室溫下。幻燈片被清洗、脫水乙醇分級和脫水。一個現成的聚光燈表皮生長因子受體探針(表達載體)15µl應用於蓋玻片,放置在部分,和邊緣密封。幻燈片變性在熱板(94°C) 5分鍾和雜交進行隔夜37°C調濕室(Dako做好:Dako, Carpinteria,加利福尼亞,美國)。進行嚴格的清洗與檸檬酸0.5×標準鹽水在75°C 5分鍾;PBS /漸變20洗了兩次2分鍾。部分被封鎖H為3%2O2,用甲醇稀釋10分鍾和PBS洗了兩次2分鍾。非特定的染色法被應用Cas-Block(聚光燈CISH檢測設備)和孵化了10分鍾。孵化用鼠標anti-Dig抗體30分鍾後在室溫下,這種聚合的過程持續了孵化HRP-antimouse抗體和substrate-chromogen解決方案(DAB) 30分鍾每一步與蘇木精複染色5 s。組織在乙醇脫水和蓋玻片Tissue-Tek棱鏡/電影(美國加州托蘭斯,櫻花Finetek公司)。聚光燈的7號染色體著絲粒探針被用來檢查多染色體(表達載體)。
評價CISH和魚的結果
基因狀態決定根據製造商的標準和分類三個類別:沒有放大(1 - 5基因的存在/ > 50%的癌細胞核);低放大(6 - 10基因的拷貝,或一個小的基因簇,現在每核癌細胞> 50%);放大(> 10冊,或大型集群,每核基因的存在腫瘤細胞> 50%)。隨後分數分為兩類:沒有放大,放大。整個擴展核心的評估計算平均每樣1核。
統計分析
χ分類變量進行分析2測試或確切概率法在適當的時候。的敏感性和特異性CISH計算使用魚作為黃金標準。水平的重要性設置為5%,所有的測試。是由SPSS統計分析軟件,V.17.0 (SPSS,芝加哥,伊利諾斯州,美國)。
結果
臨床病理的結果
臨床病理和分子信息中描述表1。樣品由52例OSCC(40男,12女性)與平均年齡為56.3歲(範圍從16到80)。描述的T-staging和n分期的腫瘤是根據與(美國癌症聯合委員會)/ UICC(國際癌症控製聯盟)口腔癌的分類。9惡性腫瘤是年級如下:17(32.7%)高分化,14(26.9%)中度分化和21(40.4%)低分化腫瘤。最常見的影響網站是嘴裏的舌頭和/或地板(75%);大多數的節點參與和展示這些病變分類為低分化。吸煙者占81%的病人,其中18.8%顯示超過20支/天的消費。飲酒習慣被64.3%的患者報告。吸煙者的趨勢呈現高檔觀察腫瘤,主要消費時高於20支/天(p < 0.05)。平均隨訪6個月。
免疫組織化學、魚和CISH結果
immunoexpression的模式是一個獨特的棕色染色在腫瘤細胞的細胞質膜,和28例(53.8%)病例是積極的(圖1A)。CISH檢測基因擴增3(5.8%)例和魚在8例(15.4%)(圖1B, C)。放大檢測到CISH和魚沒有蛋白質超表達發生在2(3.8%)例。一個(1.9%)例顯示放大檢測到CISH和魚和蛋白質過度相符。5例(9.6%)顯示魚離開CISH放大放大和蛋白質過度。
表皮生長因子受體(EGFR)蛋白表達,在口腔鱗狀細胞癌基因擴增。(一)陽性染色膜的腫瘤細胞(×400放大)。(B)放大的EGFR檢測到顯色原位雜交(×400放大)。(C)放大EGFR檢測到的熒光原位雜交(綠色信號集群代表EGFR基因的擴增,和紅色的信號表明染色體的著絲粒區域7)(×1000放大)。
表皮生長因子受體表達和放大(CISH和魚)在低級的腫瘤更頻繁,但沒有意義(p > 0.05)。表皮生長因子受體表達和魚結果顯示與臨床病理的特點。放大檢測到CISH T3-T4狀態有關(p = 0.02)。沒有關聯蛋白表達和基因擴增;然而,6 8例魚的放大顯示積極的EGFR染色。三種情況下,考慮由CISH放大,也顯示,魚放大試驗,表明敏感性37.5%和100%的特異性後CISH接受者操作特征曲線分析。
討論
臨床試驗表明,一個有趣的活動作為治療HNSCC表皮生長因子受體抑製劑。10,11然而,一些問題還需要解決,如何評估EGFR表達或是否有表皮生長因子受體表達與患者預後之間的相關性。12
EGFR蛋白進行靶向治療已經被報道在HNSCC 70 - 90%,和基因擴增的發病率已經證明在大約17 - 31%。一些作者發現表皮生長因子受體超表達和放大與HNSCC腫瘤分化差、預後差。4,10,13 - 15然而,在現在的研究中,在別人,16,17大多數EGFR-positive病變表現為低度惡性腫瘤,揭示沒有聯係與病人的結果。此外,表皮生長因子受體超表達被認為是一個保護因素對局部區域複發和增加輻射敏感度有關。15鮑邁斯特等18發現高EGFR水平在正常口腔黏膜呈現細胞不太敏感的致癌物質,這可能增加永久致癌物影響的生理反應。
在這項研究中,我們使用一個便利樣本,考慮,OSCC表明EGFR的42歲提高到58%。在先前的研究中,我們已經演示了表皮生長因子受體在OSCC的50%。16很多情況下,以前的研究在目前的就業。關於TMA方法,蒙泰羅等8表明,使用兩個1.5毫米核心提供了一些優勢,如樣品丟失的概率較低,尤其是在異構的腫瘤。此外,作者展示了很強的相關性之間的ki - 67和EGFR標記雙核心TMA OSCC的整個部分。8然而,在我們的研究中,我們使用一個1毫米核心從每一次的小切口活檢樣本的大小。
薩博等14給一個合理的解釋變量對EGFR蛋白檢測結果。他們在HNSCC調查樣本不同epitope-specific覆蓋整個EGFR蛋白的抗體。這些抗體識別抗原表位在細胞外區域靠近配體結合域,membrane-proximal細胞外區域,胞內域和phosphotyrosine自身磷酸化位點的表皮生長因子受體酪氨酸激酶域。14隻是檢測表皮生長因子受體胞內域在HNSCC與預後差相關。表皮生長因子受體細胞外域檢測顯示沒有臨床協會。包括本研究有不同的研究沒有發現任何EGFR表達與腫瘤的行為之間的聯係15,18,19和使用表皮生長因子受體的抗體與細胞外的關聯域。
高檔腫瘤經常被觀察到在晚期(T3-T4和轉移節點),然而通常顯示基因擴增,黃所發現的等,10發生在分化良好型的腫瘤。這個不一致可能表明表皮生長因子受體放大在OSCC行為不確定的影響,像Tsiambas所描述的那樣等。20.
我們比較了檢測表皮生長因子受體通過CISH和魚技術放大。與其他研究,我們發現這些技術之間的實質性差異。考慮魚作為黃金標準技術,CISH展現出了強大的特異性,但低敏感性,因為隻有37.5%的病例被CISH放大魚。它應該是由於這一事實評價邊緣信號可以在CISH更具挑戰性。信號被preanalytical高度影響因素的低信號強度或高背景染色可能觀察到,從而削弱一個正確的解釋。研討會這一發現排除了使用CISH作為檢測工具表皮生長因子受體在OSCC基因擴增。
令人驚訝的是,基因擴增與蛋白表達相關性差。因此,觀察到其他人,某些情況下顯示蛋白質過度盡管基因擴增,以及逆。19,20.,24 - 26日需要等27認為這可能是由於不同的方法來評估EGFR和preanalytical問題的狀態。對於薩博等,14抗體的特異性差異可能會對此負責。他們表明,表皮生長因子受體基因擴增與蛋白表達當抗體識別蛋白質的胞內域使用。使用抗體細胞外領域沒有任何相關性。我們可以假設EGFR表達不僅不依賴於基因拷貝數,而且蛋白質表達的增加並不預測放鬆管製的特定基因。它表明,其他機製不受EGFR放大可能參與了表皮生長因子受體在OSCC的上升。
我們得出結論,不存在EGFR蛋白表達之間的聯係表皮生長因子受體基因拷貝數在OSCC使用在本研究中使用的方法。表皮生長因子受體超表達和EGFR拷貝數與OSCC的臨床病理的特點有關。EGFR可能仍然是有用的預測標誌,盡管為此,有必要建立是最好的方法來評估表皮生長因子受體狀態及其應對治療的關係。
確認
作者感謝吉奧瓦尼博士Dantas本人交出密碼Cassali,大學聯邦德·米納斯吉拉斯,他的科學援助。
引用
腳注
貢獻者我們聲明,每個作者都有了足夠的知識內容提交。之後,FOGN SFS參與數據采集,進行實驗,並幫助起草的手稿。MCFA參與這項研究的概念,解釋數據和起草的手稿。RMR幫助實驗和至關重要的修訂,以及起草的手稿。所有作者閱讀和批準最終的手稿。
資金這項研究得到了國家研究基金會的米納斯吉拉斯(FAPEMIG-CDS apq - 1580;企業管理學院德帕羅基金會PPM 0516 - 11),盡管做Estado de聖保羅(FAPESP)必須占州政府和國家科學技術發展委員會(CNPq)。
相互競爭的利益一個也沒有。
倫理批準倫理批準由大學的研究倫理委員會提供聯邦德·米納斯吉拉斯(87/07)。
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