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介紹結節病是一種無法治愈的,慢性肉芽腫性疾病主要包括肺和淋巴結的原因不明,治療非特異性抗炎和免疫抑製藥物。持續症狀的病人禁用惡化,可能致命的臨床過程。確定一個可能的感染原因,我們相關的病例對照研究的臨床信息的存在細菌的DNA在結節病縱隔淋巴結與控製在癌症手術淋巴結切除。
方法我們回顧性研究了formalin-fixed,石蠟包埋,縱隔淋巴結從30結節病的患者和30控製肺癌患者。核酸提取的節點,計算為細菌核糖體RNA PCR 16 s核糖體DNA和結果排序並與細菌序列庫。臨床信息是相關的。
結果11/30(36.7%)的患者的淋巴結結節病已檢測到細菌的DNA,遠遠超過控製病人淋巴結(2/30,6.7%),p = 0.00516。在演講中,19/30(63.3%)例結節病患者症狀包括所有患者檢測到細菌的DNA。放射學,有18個階段我和12 II期患者。所有的II期患者症狀,75%有PCR-detectable細菌。平均隨訪52.8±32.8個月後,所有患者PCR-detectable細菌在本係列中被持續的症狀需要治療。
討論36.6%的結節病檢測到細菌的DNA在演講中,所有這些患者症狀,大多數是放射學高級階段II。這些發現表明,細菌DNA-positive症狀患者更激進的結節病,長期堅持,可能會受益於針對這種推測慢性肉芽腫感染抗菌治療。
- 細菌學
- 微生物學
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本研究的優點和局限性
盡管許多之前的研究已經證明了一致(主要非典型分枝杆菌和細菌的DNA的存在丙酸菌屬曼秀雷敦)在結節病組織中,當前的研究是第一個與臨床結果與檢測細菌DNA的存在,暗示治療最有前途的候選人。
然而,細菌的分子生物學方法檢測具有明顯的限製包括可能出現的假陽性結果二次汙染PCR試劑,石蠟包埋過程或postembedding石蠟塊的處理和加工。同時,純粹的物理存在細菌DNA的淋巴結並不能證明該疾病是由微生物引起的。
此外,淋巴結陽性細菌DNA的數量可能大大低估了由於formalin-fixation的傾向和石蠟包埋過程分解原核DNA。
介紹
結節病是一種多係統、肉芽腫性疾病的病因學是模糊的和有爭議的。不過,條件是相對常見的年齡調整年度發病率明顯高於非裔美國人(35.5例/ 100 000)和位美國白種(10.9例/ 100 000)。估計有一百萬人在美國有這種疾病。基於當前的315年556年000年,美國人口將有大約38 605例新病例的結節病,今年剛剛超過1000(2.6%)將死於這種疾病。1,2
疾病的基本病理異常的形成non-caseating上皮樣肉芽腫,通常把不溶性的外國材料,由一個吞噬細胞不能被刪除。結節病的關鍵特性是激活CD4 T細胞分化成1型輔助T細胞,分泌白介素2和幹擾素γ,增加巨噬細胞腫瘤壞死factor-α和放大局部細胞免疫反應。3,4肉芽腫性炎症會幹擾當地組織內穩態導致器官損傷。
因為肺部結節病主要包括眼睛和皮膚,注意力都集中在機載環境可能觸發這種假定過敏反應的抗原T細胞介導的細胞免疫應答。3類似的肉芽腫反應可以從多種傳染性病原體包括分枝杆菌,寄生蟲(血吸蟲)和真菌(coccidiomycosis)。早期研究報道聯想non-infective代理包括鈹、鋯、鋁、火爐樹花粉、粘土土壤,滑石,殺蟲劑,無機粒子和發黴的環境,但這些理論經曆了原因。3,5,6也有多方麵的結節病的發病率增加發生在兄弟姐妹和父母,以及一致的強有力的協會與特定的基因產物如類人類白細胞抗原I和II級,這可能增加了家族的聯係。
雖然沒有直接從結節病組織培養的傳染病,臨床症狀和免疫學特性提供最有力的支持微生物病原學,至少在某些病人。5 - 7探索可能的感染導致患者莫菲特癌症中心,我們相關的臨床表現和長期隨訪病人與結節病細菌DNA的存在在存檔,手術切除縱隔淋巴結。結節病的結果節點與控製淋巴結切除的肺癌手術淋巴結陰性,I期非小細胞肺癌患者。
方法
監管
組織在這個病例對照研究和臨床數據得到批準後由莫菲特癌症中心科學審查委員會協議MCC # 16131和# 108656的南佛羅裏達大學IRB協議。
研究設計
通過搜索莫菲特癌症中心的外科病理學數據庫2000年1月1日至2010年4月1日,我們回顧性30個隨機選擇的患者被診斷為結節病典型的影像學和臨床表現的基礎上,和組織學發現淋巴結的類上皮granulomata non-caseating無菌隻有縱隔鏡檢查,以避免可能的微生物汙染通過內鏡活檢。特殊汙漬微生物呈陰性的標本。包含在這個組,下麵的標準被用來診斷結節病:(1)胸片和胸部CT發現對稱縱隔和肺門腺病有或沒有reticulonodular肺部浸潤字段(參見圖1);(2)正電子發射斷層掃描(PET)掃描顯示葡萄糖貪欲的淋巴結腫大(見圖2);(3)無症狀表現或呼吸困難的典型症狀,咳嗽,胸悶或疼痛,盜汗,發燒、疲勞、不適、皮疹或減肥;(4)淋巴結顯示支流的組織學特征,non-caseating granulomata和(5)任何已知微生物通過曆史或文化granulomata被排除在外的原因。綜述了所有組織病理學標本的作者之一(PS)來確認診斷最初由部門在莫菲特病理學家。
對比度增強胸部CT在兩個不同的軸向水平顯示典型的對稱肺門和縱隔腺病。
正電子發射斷層掃描/ CT(冠狀視圖)的對稱hypermetabolic縱隔和肺門淋巴結(箭頭)。
確保無菌收集,所有控製標本取自淋巴結切除在打開胸廓切開術(政治)作者之一在30(1:1匹配情況下)隨機選擇階段IA非小肺癌患者。淋巴結被選隻能從外圍腫瘤小,患者沒有阻塞性肺不張,也沒有主動感染的證據。報告的作者之一(PS)審查所有控製淋巴結組織學驗證是否有轉移,急性炎症或granulomata。
臨床數據
臨床病人的人口統計數據,初步表現症狀和客觀的研究結果從電子醫療記錄中提取所有結節病的患者報告的作者之一(政治)。患者分級使用修改後的竹莢魚影像學分期係統:階段0正常胸部x光片;階段1肺門和縱隔腺病;階段2腺病和肺浸潤;第三階段單獨肺浸潤和舞台4肺纖維化。4長期隨訪患者臨床狀態和後續治療方案結節病得到從電子醫療記錄和電話記錄病人或其直係親屬。
DNA提取
消除識別信息、formalin-fixed石蠟包埋塊淋巴結結節病和控製患者被送往實驗室醫學和微生物學的部門華盛頓大學(西雅圖,華盛頓,美國),調查人員在哪裏瞎了標本的身份。從石蠟包埋塊中提取的DNA進行石蠟被孵化後在二甲苯使用羅氏HighPure PCR模板淨化設備(羅氏診斷GmbH,曼海姆,德國)。8一些負麵患者樣本(與本研究無關的)包含在每一批排除任何汙染。抑製被檢查排除體內添加目標DNA的能力被放大在同一個PCR混合,包含從臨床標本中提取的DNA。結核分枝杆菌和巴爾通氏體屬henselae已發現在過去多次使用這些PCR檢測。16 s引物的廣泛用於所有細菌。hsp65和rpoB是廣泛的分枝杆菌spp。16 s PCR檢測非分枝杆菌spp DNA等丙酸菌屬曼秀雷敦。分枝杆菌spp hsp65 DNA進行檢測和/或rpoB引物。引物用於放大也用於擴增子測序。PCR擴增子直接測序;不需要進行克隆。混合感染中沒有檢測到這組標本。使用對齊,BLASTN。在所有情況下識別是基於精確匹配。沒有序列不能與微生物檢測。
P曼秀雷敦由16 s引物檢測,鳥型分支杆菌被hsp65引物檢測。M鳥結核檢測和識別的序列分析。
結果
的人口和臨床特征30結節病病人的研究發現表1。
人口統計資料
病人年齡平均52.5±12.3年(53年,中值範圍30 - 75年)。男:女比例是十四16。種族(22)包括白人73.3%,黑人16.7%(3)(5)和西班牙裔10%。大多數病人體重超標:平均身體質量指數為31.4±6.9,平均28.5和18.8 - -47.3範圍。
臨床表現
最初的時候表示,19歲的30例(63.3%)症狀,通常與多個症狀。19個病人,診斷前症狀的持續時間平均22.1±30.0個月(平均12個月,範圍1 - 120個月)。最常見的症狀是盜汗9(30.0%),呼吸困難8(26.7%),胸部疼痛7(23.3%)、胸悶5(16.7),發燒3(10.0%)、疲勞3(10%)、皮疹(6.7%)和胃潰瘍2 (6.7%)。其他症狀出現在至少一個病人包括消化不良、吞咽困難、腹瀉、便秘、腎結石、關節和肌肉疼痛,orthopnoea,鼻子和嘴巴皮膚病變,斷斷續續的支氣管痙攣、倦怠和減肥。
並發症包括哮喘2(6.7%)、冠狀動脈疾病2(6.7%)、糖尿病4(13.3%)和高血壓5(16.6),和一個痛風,甲狀腺功能減退,濕疹、纖維肌痛和克羅恩病。惡性腫瘤是非常常見的,超過一半(53.3%)的當前或之前的腫瘤,發現前所述。12前惡性腫瘤或演講的時候乳房3,黑色素瘤3,子宮2,肉瘤3,扁桃體1,子房1,腎上腺,結腸癌1和霍奇金淋巴瘤1。
影像學研究
胸部CT進行所有30個病人和對稱的縱隔和肺門腺病。四30個病人(13.3%)有明顯的腹部腺病。肺結節中12例(40%)和射線II期結節病。另一個18例(60%)有階段我的疾病。所有12 II期患者症狀。PET / CT掃描進行25的30例結節病。所有患者證明葡萄糖貪欲縱隔和肺門淋巴結腫大(見圖2在典型的例子),葡萄糖貪欲的腹部異常節點在下麵的四個患者影像學腺病隔膜。
實驗室結果
十二30患者淋巴結組織發送縱隔鏡檢查時進行有氧,真菌和分枝杆菌文化。所有文化沒有顯示出增長6周後孵化。
細菌的DNA PCR檢測
十一30淋巴結(36.7%)在結節病細菌DNA聚合酶鏈反應。隻有2 30(6.7%)控製的病人被發現有細菌DNA的淋巴結。每組中的微生物所示表2。有更多的結節病淋巴結陽性患者微生物DNA比控製淋巴結:11/30和2/30,p = 0.00516 (2-tailed p值);獨聯體1.6115到40.7675或者是8.1053 95%,p = 0.0111。
所有可檢測到細菌的DNA結節病在淋巴結(36.7%)症狀。此外,73%(8/11)的細菌DNA-positive結節病的患者在症狀表現,影像學II期疾病。
長期隨訪
長期隨訪完成在25 30個(83.3%)結節病的患者,平均隨訪50.4±28.2個月(平均48個月,範圍4 - 132個月)。五個病人死亡:三個從癌症,一個來自慢性阻塞性肺疾病和一個來自未知的原因。其他五個病人失去了直接後續仍然生活基於信息從社會保障獲得死亡指數。13
10例結節病的細菌的DNA中發現的淋巴結在本係列誰長期隨訪是可用的,所有的症狀在平均隨訪52.8±32.4個月(平均47個月範圍12 - 136個月)。一個額外的細菌DNA-positive病人失訪。
討論
這個病例對照研究的目標是雙重的:(1)評估無菌中記錄患者淋巴結切除結節病細菌DNA的存在的分子方法和(2)關聯結果與病人的臨床特點。
細菌的DNA
正如所料,利用PCR分子檢測表明,超過三分之一的結節病的患者(36.7%)有細菌DNA的證據節點,表示過去或當前參與這些微生物。這個比例範圍中發現的細菌DNA-positive標本瀑布眾多之前發表的研究從過去二十年(使用各種方法),從26%到80%不等的積極(表35,7,14日至17日)。此外,非典型分枝杆菌和P曼秀雷敦代表了幾乎所有的DNA鑒定,還與多個之前的研究的結果一致(表3)。另外確認是皮膚和粘膜組織(棒狀杆菌屬propinquum),和一個需氧革蘭氏陰性杆菌(Duganella zoogloeoides),通常是發現在水環境中。有趣的是,後者病人(沒有。13)D zoogloeoides是一個石棉技師來自熱帶海地。作為一個免責聲明,微生物的DNA的發現淋巴結並沒有告訴我們可行的生物是否存在或是否引起肉芽腫反應。
類似於之前發表的研究總結表3,更少(隻有2 30或6.7%,p = 0.00516)控製的淋巴結切除肺癌手術的時候顯示細菌DNA的證據(M鳥結核和P曼秀雷敦)。這種差異強烈表明,細菌DNA的示範結節病淋巴結是一個真正的在我們的研究中發現,在35歲之前出版的研究),他們不隻是處理汙染物,因此指著微生物作為潛在貢獻者這種疾病的成因。此外,P曼秀雷敦DNA被發現隻有1 30(3.3%)控製在我們的研究中,淋巴結Ishige形成鮮明對比等18在日本報告這個微生物作為一個無處不在的肺淋巴結共生體中發現8 11 (72.7%)non-sarcoid病人在他們的研究。在他們的研究這樣一個非常高的陽性結果可能是因為地理/民族/種族差異或潛在的汙染處理。
臨床特點
也許最有趣的發現來自PCR結果與臨床的相關性信息。所有患者淋巴結含有細菌的DNA在演講也高,75%的人症狀預後差射線II期研究結果。此外,平均4年隨訪後,所有細菌DNA-positive患者仍然高度的症狀。這驚人的相關性強烈表明,示範的細菌DNA PCR的淋巴結在初始報告是不利的,這些患者預後因子,使其不太可能有自發緩解。
事實上,如果感染的微生物觸發一個旺盛的肉芽腫性免疫反應,50 - 80%的患者通常有一個自發緩解1可能清楚的生物和免疫反應減弱。我們假設這些患者堅持疾病症狀可能繼續港口微生物,延續有力,破壞性免疫反應以及允許微生物旅行其他地方其他器官創造遙遠的肉芽腫性炎症。
本研究的局限性
等病原微生物麻風杆菌(麻風病)或冠狀病毒(嚴重急性呼吸係統綜合症)不能直接生長在文化或非常緩慢增長或難以文化等Tropheryma whippelii(惠普爾氏病)。5,19在這些情況下,探測和識別依賴於分子機製如PCR用於這項研究。然而,分子生物學方法具有明顯的局限性包括可能的假陽性結果二次汙染PCR試劑,石蠟包埋過程或postembedding石蠟塊的處理和加工。然而,在我們的研究中,30控製淋巴結以相同的方式處理和檢測到細菌的DNA隻有2/30(6.6%),顯著低於結節病節點(36.7%,p = 0.00516),這表明汙染不大可能占了調查結果。
另一個明顯的限製解釋之前和其他分子研究的結果與殖民和因果關係。微生物的發現DNA生物的節點並不能證明是積極參與疾病的發病機理。微生物可能隻是一個同桌的或理論上它甚至可能被吸引到該地區的肉芽腫性炎症。然而,明顯不同的百分比微生物DNA-positive節點在結節病和控製患者無疑是暗示由微生物疾病的因果關係。
此外,淋巴結陽性細菌DNA的數量可能大大低估了由於formalin-fixation的傾向和石蠟包埋過程分解原核DNA。隨著時間的推移,其他調查人員發現原核細菌DNA的降解(尤其是分枝杆菌)老化的石蠟包埋標本。16值得注意的是,隻有三個結節病淋巴結陽性分枝杆菌在我們的研究中還不到3歲的時候通過PCR評估。如果我們使用新鮮的淋巴結組織像德雷克等16分枝杆菌spp PCR陽性發現60%,有更高的陽性細菌的DNA結果(特別是分枝杆菌)在我們的研究中。
這項研究的意義
結節病是一種肉芽腫疾病主要涉及肺、淋巴結和其他器官的結果似乎是一個旺盛的T細胞和巨噬細胞免疫反應持續表現不佳的降解抗原。眾多non-infective代理涉及基於流行病學研究但沒有站起來的審查。1,3,5重點在過去二十年一直在感染性的代理可能會觸發結節病,與分枝杆菌中發現的最強的嫌疑人的家人和共同的共生體P曼秀雷敦。就像古典肺結核,多達90%的人感染M肺結核停留在緩解期如果不治療,20.結節病也有自發緩解率65 - 80%沒有治療。1可以推測,類似於肺結核、免疫係統,首次回應後觸發微生物,成功消除劑和免疫反應減弱。然後在20%左右的持久和進步結節病,有機體仍然可行,延續的破壞性免疫反應。
結節病症狀通常是處理各種抗炎和免疫抑製藥物如糖皮質激素、甲氨蝶呤和TNF-inhibitors(生物製品)。21到另一個相似的免疫異常和治療退行性肉芽腫病,克羅恩病,是驚人的。22肉芽腫性回腸炎(克羅恩氏)一直以來被許多研究者的結果慢性感染專性胞內微生物M鳥結核亞種副結核(地圖)導致的肉芽腫性回腸炎牛和其他反芻動物稱為慢性細菌性腸炎。23盡管經典治療克羅恩病與免疫抑製藥物與結節病一樣,許多最近的研究表明一個更有效的治療用更少的副作用可能是一個三重抗生素療法針對公認的引發劑地圖。24 - 26日事實上,許多領域的懷疑,這種細胞內生物(MAP)駐留在巨噬細胞損害正常的自噬,通常會根除有機體。24代理提高16α-bromoepiandersterone自噬等,27,28目前在人體試驗,可能隨著抗生素在克羅恩病有效。24
可以等抗菌/抗療法用於克羅恩病改變結節病的自然曆史長期症狀患者?六十年前的小型試驗使用古典antituberculous藥物(異煙肼、鏈黴素或可的鬆)發表了令人沮喪的結果。29日然而,非典型分枝杆菌(而不是M肺結核),更可能是結節病病原學的代理之一,幾乎都是耐異煙肼等公開的標準。實現了如果等其他生物P曼秀雷敦或者細胞壁缺陷細菌(L-forms)觸發和延續結節病在某些個人,那麼標準antituberculous藥物也將是無效的。
四環素衍生品(二甲胺四環素和強力黴素)以及抗瘧藥氯喹已被證明是非常有效的治療皮膚結節病。36二甲胺四環素可以產生完全反應在三分之二的情況下,盡管它是辯論是否這是一個抗菌效應或immunomodulating效應。37
注意最近轉向隨機結節病的治療試驗各種抗菌藥物。德雷克等38先發表積極的結果的隨機試驗(NCT01074554)的抗菌療法(針對非典型分枝杆菌)在美國使用口服伴隨左氧氟沙星,乙胺丁醇,阿奇黴素和利福平(清晰)方案治療30皮膚結節病的患者,用相當顯著減少皮膚損傷的大小。古普塔等39結節病及其相似的全麵審查肺結核的結節病並抗結核藥物治療通常生成一個令人信服的理由。古普塔也是一個正在進行的臨床試驗的主要研究者在印度使用更多的標準antituberculous療法”利福平和異煙肼與強的鬆相比單獨強的鬆治療結節病:一個試點隨機對照試驗”(ClinicalTrials.gov標識符:NCT01245036)。40這項試驗的結果在印度結核病高負擔的明年將是可用的,盡管使用的藥物療法可能不是有效的結核病負擔較低的國家。如果結節病起源於異常免疫反應微生物(s),病人的地理位置可能決定涉及微生物和抗菌療法是最有效的。
結論
在過去的三十年裏,許多研究已經檢查結節病的方方麵麵包括其功能失調的免疫反應。主要治療各種形式的免疫抑製,但這隻對症狀和似乎並沒有改變疾病的自然史。4,21許多研究(表3)一再證明的證據,微生物在30 - 80%的結節病組織,主要是各種分枝杆菌和P曼秀雷敦更不可能保證這些分子的研究。
也許我們應該效仿的克羅恩病腸胃科24,25和繼續治療臨床試驗使用的多種抗生素持續症狀患者,結節病晚期。事實上,如果有一個持續的、可行的微生物感染導致持續或漸進衰弱症狀和器官衰竭,抗生素可能會積極影響這種疾病的進程。
引用
腳注
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資金這個項目是由w·保羅Hoenle基金會的資助,薩拉索塔,佛羅裏達州34242,美國。
相互競爭的利益材料是工作的結果支持資源和使用設施莫菲特癌症中心(政治、PS和RLS)和華盛頓大學(dj和議會)。細菌鑒定的分子微生物學實驗室華盛頓大學醫療中心http://depts.washington.edu/molmicdx
倫理批準機構審查委員會,南佛羅裏達大學醫學院,佛羅裏達州坦帕市。
出處和同行評議不是委托;外部同行評議。
數據共享聲明額外的數據可以通過森林女神訪問數據存儲庫http://datadryad.org/與doi: 10.5061 / dryad.23k48。