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基本原理Proline-glycine-proline (PGP),中性粒細胞化學引誘物來自膠原蛋白的酶分解,升高在痰患者的慢性阻塞性肺疾病(COPD)和可能導致疾病進展。痰的PGP水平是否應對治療慢性阻塞性肺病或預測結果是未知的。
目標我們進行了一項研究輔助的多中心試驗的功效阿奇黴素治療1年測試是否在預防慢性阻塞性肺病急性加重痰的PGP被治療或改變頻率和惡化有關。
方法我們收集殘骸痰化驗和試驗參與者在PGP的盲評,髓過氧物酶和基質金屬蛋白酶9 (MMP)以及從膠原蛋白生成PGP的能力體外。一旦父母試驗選取,結果與用阿奇黴素或安慰劑和急性加重的參與者。
結果阿奇黴素治療顯著降低痰PGP和髓過氧化物酶水平在COPD患者,特別是增加治療的持續時間。我們沒有發現差異痰MMP-9或PGP代參與者之間服用阿奇黴素或安慰劑。痰PGP最高水平的惡化和拒絕與成功的治療。
結論這些數據支持作用的PGP驅動COPD氣道和實質中性粒細胞炎症進展和惡化,並提供新信息對大環內酯類的抗炎作用。PGP可能有潛力作為新型抗炎治療在慢性阻塞性肺病和目標作為生物標誌物的臨床試驗。
- PGP
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本研究的優點和局限性
本研究進行了輔助多中心,前瞻性,平行組,安慰劑對照,雙盲研究阿奇黴素的功效的慢性、門診慢性阻塞性肺疾病(COPD)的管理。
我們證明慢性阿奇黴素治療減少proline-glycine-proline水平(PGP),一個collagen-derived中性粒細胞化學引誘物,COPD患者的痰。
這提供了新信息對大環內酯物抗生素的抗炎作用和支持作用的PGP COPD發病機理和生物標誌物在臨床試驗中。
參與者的數量包括在這項研究是小如痰樣本隻有少數的參與者在父審判。
介紹
Proline-glycine-proline (PGP)是細胞外基質的分解產生的三肽膠原蛋白,是專門為中性粒細胞趨化因子在體外和體內。1PGP施加其趨化現象的效果通過與一個關鍵序列同源性ELR基序+科學家趨化因子和受體結合,CXCR1 CXCR2。1PGP的行動從本地生成膠原蛋白neutrophil-derived基質金屬蛋白酶(MMPs) 8和9,裂開的膠原蛋白寡肽,緊隨其後的是一個次要prolyl乳溝的肽鏈內切酶,2神經元酶與高血壓和神經肽處理。Prolyl肽鏈內切酶也出現在中性粒細胞可能參與代PGP。3PGP是肺分解白三烯的氨肽酶的活動4水解酶(LTA4H),迄今為止隻有被公認為一種酶促炎的通過代白三烯B4。4因此,急性PGP-driven中性粒細胞炎症可能是由本公司終止4氨肽酶h .香煙可以選擇性的滅活,但不是水解酶,英國網球協會的活動4PGP的H,從而允許積累,而促進中性粒細胞炎症。4
我們以前證明PGP是一個潛在的痰液和血清生物標誌物在慢性阻塞性肺病(COPD),囊性纖維化(CF)和慢性肺移植排斥,這些疾病導致中性氣道炎症。2,5,6口水從CF和慢性阻塞性肺病患者從膠原蛋白體外生成PGP。2,5在CF痰更高水平的PGP發作和成功治療和分辨率下降。2PGP水平是否可以修改的門診治療肺部疾病或這些變化是否能積極影響臨床結果沒有被測試。這是重要的,因為生物標誌物尚未確定,可以可靠地援助在慢性阻塞性肺病的診斷和表現型或作為代理端點的臨床試驗。識別等生物標誌物是一個關鍵的優先事項。7,8
現有的幾種不改變中性氣道和肺實質炎症在慢性阻塞性肺病疾病進展的核心,因此不會阻止肺功能的喪失。因此,有必要對新療法。一個候選人是阿奇黴素,大環內脂類抗菌素消炎。阿奇黴素和其他大環內酯類已被證明在慢性有益,中性氣道疾病,如支氣管擴張,分散panbronchiolitis和CF。9,10這些影響被認為是由於,在某種程度上,不僅至今原因不明的抗炎活性和抑製細菌生長。11
國家心肺和血液研究所(NHLBI)最近發起一項多中心試驗中阿奇黴素的穩定的門診病人與慢性阻塞性肺病(大環內酯物試驗)。12大環內酯類已經被證明能降低MMP的活動在肺部疾病,包括慢性阻塞性肺病,11,13,14我們提出有益的阿奇黴素可能通過降低PGP介導的。因此,我們進行了一項研究輔助痰收集到的大環內酯物試驗參與者進行微生物分析分析了PGP和從膠原蛋白生成PGP的能力。一旦父母試驗的代碼被打破了,我們相關的PGP水平使用阿奇黴素或安慰劑和臨床反應。本報告結果。
方法
病人招聘
這項研究是作為一個輔助研究的大環內酯物試驗NHLBI慢性阻塞性肺病的臨床研究網絡(CRN)。這是一個潛在的,平行組,安慰劑對照,雙盲研究阿奇黴素的功效的慢性、門診管理的慢性阻塞性肺病的主要結果的時間先惡化。12COPD患者,選擇高危急性惡化,隨機接受阿奇黴素每天250毫克或安慰劑為12個月。鼻咽拭子從參與者在試驗各點(隨機,後1、3、6、9和12個月的治療後,1個月完成),屏幕為殖民macrolide-resistant病原體。在有限數量的參與者,痰液樣本也獲得了微生物分析。在目前的研究中,我們從這些參與者獲得殘餘痰測量的生物標誌物。
PGP測量,髓過氧物酶和MMP-9痰
痰與生理鹽水稀釋1:1,10 kDa過濾器過濾,用40µL 1 N鹽酸和化驗PGP的電噴射ionisation-liquid色譜-光譜/質譜(ESI-LC-MS / MS)如前所述。2,5檢出限是10 pg / mL。
髓過氧物酶測定痰使用商用活動試驗(Calbiochem,聖地亞哥,加州,美國)。樣品和標準被添加到井塗有多克隆抗體為2 h人類髓過氧物酶和孵化。檢測試劑(tetramethylbenzidine和氫過氧化物酶)補充道,和1 h後吸光度是閱讀在450海裏。活動轉化為ng / mL活躍髓過氧物酶使用標準曲線。
總濃度和pro-MMP-9決心在痰液使用商用ELISA試劑盒(研發係統,明尼阿波利斯,明尼蘇達州,美國)。樣品和標準添加到井塗MMP-9單克隆抗體,在室溫下孵化2 h。fluorogenic襯底(Fluor-Pro-Leu-Gly-Leu-Ala-Arg-NH2)添加和板是孵化18 h在37°C。活動是量化使用分光光度計與激發和發射波長的320和450海裏,分別轉換為ng / mL活躍MMP-9使用標準曲線。
代的PGP體外
一百微升的痰與廣泛滲出(對dH孵化2O與pH值調整到4.5添加冰醋酸)完整I或II型膠原蛋白(10µL, 1毫克/毫升,Sigma-Aldrich,聖路易斯,密蘇裏州,美國)為24小時37°C和5%的公司2。樣本10 kDa的過濾器,過濾40µL 1 N鹽酸清洗和分析使用ESI-LC-MS /女士PGP的水平。大量的PGP生成的每個樣本測定與PGP相比沒有膠原蛋白由痰培養。
數據分析
痰液樣本被認定為來自參與者服用阿奇黴素或安慰劑一旦大環內酯物試驗完成並選取。加重了每個參與者的數量和日期出現症狀惡化都被記錄下來。數據意味著±SEM。痰生物標誌物水平和活動使用學生t測試組間比較。所有p值< 0.05被認為是重要的。
結果
阿奇黴素減少痰PGP和髓過氧化物酶與安慰劑比較時間的方式
我們一共獲得了46名慢性阻塞性肺病患者的痰樣本招募到大環內酯物試驗和化驗的盲評等級的PGP。截斷符號父試驗顯示,有18的痰樣本13接受安慰劑的參與者和14的痰樣本8 azithromycin-treated參與者收集月1到12的治療。臨床特點的研究參與者與父母相似的試驗(= 67.6±8.4歲,30%女性,postbronchodilator FEV1= 1.36±0.47 L,平均數±標準差)。
痰PGP水平顯著高於在參與者服用安慰劑相比,服用阿奇黴素在審判期間(5.15±1.54 vs 2.27±0.87 ng / mL, p < 0.05;圖1)。痰PGP是最大的差異在9月和12,顯示阿奇黴素治療的累積效應(圖2)。考慮到有限的數據集,阿奇黴素治療對PGP的影響水平報告組。然而,有痰PGP逐步下降,尤其是治療時間在5 6 azithromycin-treated參與者的痰化驗在多個時間點。
阿奇黴素治療減少proline-glycine-proline (PGP)水平在慢性阻塞性肺疾病患者的痰與安慰劑相比。插圖:值代表濃度均值±SEM PGP口水(* p < 0.05 vs安慰劑)。
痰proline-glycine-proline (PGP)水平下降的持續時間增加阿奇黴素治療。PGP水平顯著高於在參與者接受安慰劑相比阿奇黴素治療9個月和12 (* p < 0.02),但不是在1到6個月(p = 0.32)。
痰髓過氧物酶活動參與者之間的差異在過去12個月內服用安慰劑或阿奇黴素的審判沒有統計學意義(3391±353 vs 2884±349 ng / mL, p = 0.16)。然而,痰髓過氧物酶低參與者服用阿奇黴素從6個月到12個(3321±430 vs 2398±290 ng / mL, p < 0.05),表明累積阿奇黴素治療對中性氣道炎症的影響。
沒有區別參與者服用安慰劑或阿奇黴素痰MMP-9活動(11.18±3.98 vs 8.39±2.42 ng / mL, NS)或從膠原蛋白體外PGP代(3.28±2.25 vs 2.94±1.73 ng / mL, NS)在審判。
痰PGP下降與COPD患者惡化頻率降低
在大環內酯物試驗中,用阿奇黴素治療顯著降低惡化頻率在高危患者COPD與安慰劑比較(1.48 vs 1.83每個病人發作,p = 0.01),增加了時間先惡化。12我們看到一個類似的惡化頻率減少參與者服用阿奇黴素在我們的輔助研究雖然這並不重要因為我們學習小組的小尺寸(0.91±0.37 vs 1.93±0.62發作患者,p = 0.08)。
痰PGP升起在慢性阻塞性肺病急性加重和分辨率下降
我們獲得了經曆急性加重的日期在大環內酯物試驗參與者,包括安慰劑和azithromycin-treated團體和相關痰PGP的時間在天最親密的惡化。這導致了一個有趣的模式,建議提前PGP水平急劇上升的惡化和迅速下降(圖3)。事實上,痰PGP是更高的惡化(18±4天之前或之後,PGP 12.8±4.53 ng / mL;比之前n = 9)(103±37天,PGP 1.10±0.411 ng / mL, n = 6;p < 0.02)或在一個惡化(141±11天,PGP 2.15±0.80 ng / mL, n = 11, p < 0.02;圖3插圖)。有一個趨勢惡化後痰PGP高於前(p = 0.133)。
痰proline-glycine-proline (PGP)水平最高的慢性阻塞性肺疾病惡化。值代表PGP水平在不同天相對於發病的惡化(時間0)。插圖:值代表濃度均值±SEM PGP痰收集103±37天前惡化(前),18±4天之前或之後的惡化(妖精)或141±11天後一個惡化(post)。* p < 0.02 (pre vs仙女),#p < 0.02 (post vs peri)。
討論
PGP是中性粒細胞化學引誘物在體外和體內,導致氣道炎症慢性肺部疾病與一位著名的嗜中性粒細胞組件包括慢性阻塞性肺病和CF。2,5,6慢性滴劑PGP的小鼠肺導致肺氣腫和右心室肥大1和抑製PGP補充肽(arginine-threonine-arginine)減少香煙煙霧誘發急性嗜中性粒細胞湧入到老鼠肺部和防止肺氣腫和右心室肥大在慢性阻塞性肺病的小鼠模型。15,16然而,直接證據暗示PGP在COPD發病機製在人類缺乏。數量有限的痰樣本提供給我們由於大環內酯物試驗的設計,我們證明了PGP是減少COPD患者服用阿奇黴素的航空公司,特別是治療和伴隨著時間的延長和嗜中性粒細胞減少負擔,以痰髓過氧物酶來衡量。減少痰PGP伴隨著積極的臨床反應阿奇黴素(頻率降低惡化)。我們的小組有一個類似的治療反應在父試驗,表明我們的發現可以普遍整個大環內酯物組。
盡管隻有少數標本,痰PGP是明顯升高,隻要前35天出現症狀的急性加重的慢性阻塞性肺病和短暫。它成功的治療和分辨率的大幅下降(圖3)。Seemungal等17描述了一個7天的前驅症狀,呼吸道症狀惡化之前發作的惡化,但未能預測急性加重肺量測定法。我們的數據表明,氣道炎症可能惡化提前幾周的PGP可能預測一個惡化的發生在症狀出現之前,允許早期幹預。盡管許多生物標記描述了慢性阻塞性肺病的,據我們所知,沒有一個被證明預示著加重。18發作後的持續升高痰PGP長一些人可能導致持續中性氣道炎症,促進頻繁exacerbator表型。月19 - 21日
我們從我們的數據不能確定是否減少急性加重由於阿奇黴素次要降低痰PGP或是否減少痰PGP是由於少發作在azithromycin-treated參與者。回答這個問題肯定需要一個更大的,縱向研究COPD患者的PGP。然而,這些數據支持的想法PGP在COPD發病機理中起著重要作用,尤其是急性加重,並可能提供重要的線索阿奇黴素的抗炎作用的機製。PGP預測積極應對阿奇黴素在6個月內開始治療,並在這方麵優越的其他生物標記研究大環內酯物試驗的一部分。22
我們不確定的機製降低PGP阿奇黴素。大環內酯物抗生素已報告有無數的消炎作用,包括抑製MMP的活動。11,13,14MMP-8和MMP-9至關重要的細胞外PGP生成膠原蛋白的中性粒細胞,2這將提供一個有吸引力的潛在機製。然而,我們可以發現治療組之間沒有差異痰MMP-9活動。我們沒有檢查其他基質金屬蛋白酶,我們曾與PGP代,金屬蛋白酶- 1和MMP-8等。2,5我們測量PGP生成膠原蛋白的體外治療組痰但找不到差別。隨後到當前的研究中,我們已經確定了一個neutrophil-derived酶,英國網球協會4H,白三烯B4並迅速降低PGP。4我們最近發現,英國網球協會4H是控製相比,慢性阻塞性肺病痰明顯升高。23分解PGP的英國網球協會4H在我們的痰樣本可能混淆了PGP代試驗。PGP是來源於中性粒細胞活性,減少痰PGP可能反映招募中性粒細胞減少阿奇黴素的航空公司由於其他影響。痰PGP的下降是大於髓過氧物酶下降,表明PGP可能有其他影響慢性阻塞性肺病除了招募中性粒細胞。解決這些問題是本研究的範圍之外。
總之,我們的研究結果支持了這樣的觀點,即PGP中扮演一個重要的角色在COPD發病機理和阿奇黴素的抗炎機製提供線索。PGP顯示承諾的預測急性發作,可以看作是一個有用的生物標誌物在將來的研究中應對治療的慢性阻塞性肺病和其他慢性中性粒細胞肺疾病。
確認
作者要感謝美國國家心肺和血液研究所慢性阻塞性肺疾病臨床研究網絡對他們的援助為本研究提供痰樣本和臨床資料。
引用
腳注
貢獻者PJO設計研究,獲取和解釋數據,並起草了手稿。PLJ JMW收購和解釋數據。MTD和PDS痰液樣本。傑布設計研究和監督項目。所有作者導致修訂和最終批準的手稿。
資金資助這項研究來自撥款HL090999 HL110950, HL077783(傑布)和HL092296 (PJO)國家心髒和血液研究所的美國國立衛生研究院。
相互競爭的利益一個也沒有。
倫理批準倫理批準本研究提供的機構審查委員會在伯明翰阿拉巴馬大學的。批準這項研究也提供了指導委員會NHLBI COPD的臨床研究網絡進行了最初的試驗。注冊原始審判是在clinicaltrials.gov,標識符:NCT00325897。
出處和同行評議不是委托;外部同行評議。
數據共享聲明沒有額外的數據是可用的。