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摘要
目標本研究評估了GD1(甘油脫水酶)陽性含量之間的關係乳酸菌，存在乳酸菌以及輕度至中度慢性阻塞性肺病(COPD)患者宿主肺組織中測量的炎症反應。我們假設將會有GD1產量的損失乳酸菌並且GD1具有抗炎特性。
設置二級護理，加拿大不列顛哥倫比亞省溫哥華1個參與中心。
參與者74人捐獻了肺或肺葉的非癌變部分作為肺癌的治療(肺功能正常對照組(n=28)，輕度(GOLD 1) (n=21)和中度(GOLD 2) COPD患者(n=25))。
結果測量主要結局指標是各組內GD1陽性，以及這是否影響肺部炎症的定量組織學測量。次要結果測量包括乳酸菌早期COPD炎症和重構的存在和定量組織學測量。
結果細菌總數(p>0.05)與患病率乳酸菌(p>0.05)組間差異無統計學意義。然而，GD1基因在對照組(14%)中檢測到的頻率高於輕度(5%)或中度(0%)COPD樣本(p<0.05)。在GD1基因陽性的樣本中，外周血肺組織中的巨噬細胞和中性粒細胞體積分數(分別為0.012±0.005 (mean±SD) vs 0.026±0.017和0.005±0.002 vs 0.015±0.014)降低(p<0.0035)。
結論在COPD早期，GD1陽性的降低與組織免疫炎症反應的增加有關。有可能乳酸菌然而，要用作一種可能的治療方法，這些結果的驗證需要在抗炎作用之前完成乳酸菌慢性阻塞性肺病的發病率可以得到證實。
這是一篇開放獲取文章，根據創作共用屬性非商業(CC BY-NC 4.0)許可證發布，該許可證允許其他人以非商業方式分發、混音、改編、在此作品的基礎上進行構建，並以不同的條款許可其衍生作品，前提是原始作品被正確引用且使用是非商業性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/
數據來自Altmetric.com
本研究的優勢和局限性
研究直接在人體肺組織上進行。
數據顯示了一種新的潛在機製乳酸菌慢性阻塞性肺疾病(COPD)的發病機製。
患者群體得到了很好的控製，並在疾病組之間進行了分層。
乳酸菌直接在組織上進行測試，避免來自口腔和上呼吸道的潛在汙染。
少量GD1(甘油脫水酶)總陽性樣本。
簡介
慢性阻塞性肺病(COPD)是一個世界性的公共衛生問題，約10%的40歲以上人群受到影響1預計到2020年將成為美國第四大死亡原因。2先前的研究表明，1秒內用力呼氣量(FEV)的下降與血壓升高有關1)和周圍肺組織被中性粒細胞、巨噬細胞、CD4+和CD8+ T細胞和b細胞淋巴細胞浸潤，這些淋巴細胞在重度(GOLD 3)和極重度(GOLD 4) COPD患者肺中形成三級淋巴濾泡的趨勢增加。3.這些數據證明，先天性和適應性炎症免疫反應可能存在，並最初開始於早期COPD。然而，這種適應性免疫反應的目標是什麼尚不清楚。已有證據支持一種潛在的對抗彈性蛋白的自身免疫機製。4然而，其他人認為這可能是環境原因，如細菌，推動了這種免疫反應。5最近，一些研究小組提出，肺本身不是無菌的，存在可檢測到的細菌微生物群。6 - 10他們還表明，這種細菌微生物組在COPD中發生了變化。7，9這些細菌中的一些可能是COPD中觀察到的適應性免疫反應的潛在靶點，而另一些則可能具有有益的作用。
這些先前的報告中的一份確定了肺組織中的細菌微生物組乳酸菌作為一種潛在的細菌可以區分對照肺組織和COPD GOLD 4。9為了研究這可能如何有助於COPD的發病機製，本研究檢查了宿主對兩者差異的反應乳酸菌,積極和乳酸菌,陰性樣本和陽性樣本乳酸菌spp，陽性或陰性，為細菌甘油脫水酶(GD1)基因。該基因最常發現在質粒內這種乳酸菌與鉀和1,2-丙二醇一起通過脫水反應機製將甘油轉化為reuterin。11Reuterin是一種廣譜抗生素，其作用機製被假定為通過氧化應激機製起作用。12的擴張乳酸菌會減少reuterin的產生，13可能是由於群體感應。這就意味著乳酸菌當這些細菌大量存在時，將能夠將甘油轉化為廣譜抗生素reuterin。14，15基於這一信息以及之前在肺組織細菌微生物組中的發現，我們假設將會有gd1產生的損失乳酸菌並且GD1具有抗炎特性。
方法
初步數據樣本組
這些人的樣本來自之前發表的一項研究9加工方法、組織取樣方法和DNA提取方法已經發表。人口統計信息以前也曾發表過，但簡單地說，它包括來自8名非吸煙者、8名吸煙者和8名COPD GOLD 4的組織。非吸煙者和吸煙者肺功能正常，無梗阻。他們FEV1預測值分別為88.8±13.4和94.3±15.31/用力肺活量(FVC)分別為80.80±4.82和76.65±5.07。COPD GOLD 4組有FEV1(15.4±2.4)和FEV1/FVC為26.83±7.85。吸煙者吸煙包年(46.00±12.24年)與COPD GOLD 4組吸煙包年(38.83±14.97年)差異無統計學意義。
早期COPD組
組織收集
用於收集和保存肺組織進行PCR和定量PCR (qPCR)的方法先前已發表。3.，9，16，17簡而言之，74名接受肺葉切除術或肺切除術的肺癌患者捐獻的肺組織樣本被納入本研究。在所有相關機構的適當委員會批準的條件下，所有74名受試者都同意在本研究中使用他們的肺組織。支氣管擴張劑後FEV1和FEV1在術前肺功能評估期間進行的FVC測量用於將這些捐贈的組織分配給“危險”對照組(n=28)、輕度COPD (GOLD 1) (n=21)和中度COPD (GOLD 2) (n=25)。74人中有3人(2人在對照組，1人在GOLD 1組)使用了吸入糖皮質激素，所有74人在手術時都沒有臨床明顯的呼吸道感染。在這些個體中沒有記錄最近的抗生素治療信息。
qPCR檢測細菌總數和乳酸菌
對於所有的qPCR檢測，如在線補充材料中所述，應用校正因子來解釋平板變異。使用先前描述的測定方法來確定總細菌負荷並跨越16S高變異V2區域。對分析進行了一個修改，將細菌總數表達為16S/ng of DNA，而不是細菌/Rpp40。9總含量測定乳酸菌之前報道過，沒有修改過。9，18正向引物序列為5-ACG AGT AGG GAA ATC TTC CA-3，反向引物序列為5-CAC CGC TAC ACA TGG AG-3，對屬內所有種均有靶向作用乳酸菌而且Lactococcus．total的值乳酸菌以總16S細菌的百分比表示，並從歸一化到總16S(例如，(乳酸菌值/ 16 s值)×100)。兩種測定方法的標準曲線公式可在在線補充表S1中找到。
PCR檢測GD1
對所有DNA樣本進行40循環PCR，在1%瓊脂糖凝膠上得到約560 bp大小的條帶。正向引物為5-GTTCAGTCCGCCGCATATC-3，反向引物為5-GCCGCTCTTCGTGGATTTC-3。循環條件以前已經發表過。19如果一個人的兩個樣本中至少有一個檢測呈陽性，那麼這個人就被認為含有GD1基因的細菌呈陽性。
定量組織學
對編碼玻片切片進行巨噬細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)、樹突狀細胞和濾泡樹突狀細胞、B淋巴細胞、CD8+ T淋巴細胞和CD4+ T淋巴細胞染色。更詳細的染色分類可在在線補充表S2中找到。使用ImagePro Plus軟件V. 4.0 (MediaCybernetics Inc, Bethesda, Maryland, USA)，使用已建立的點計數方法計算小氣道壁組織中特異性染色的炎症細胞所占組織的體積分數(Vv)。3.評估了定量組織學的觀察者內和觀察者間誤差(見在線補充圖S1和S2)，兩者之間有良好的相關性(R2分別為0.9046和0.9485)。
數據分析
數據來自先前發表的數據集，包括不吸煙者(n=8)、吸煙者(n=8)和COPD GOLD 4 (n=8)9首先分析了GD1的患病率。角色的當前數據集上執行了隨後的分析乳酸菌早期慢性阻塞性肺病。進行了多變量分析，以評估細菌負荷，相對豐度之間的關係乳酸菌、炎症細胞Vv和氣道壁厚度。在適用的情況下，列出不同組的平均值±SD。分類數據比較分布乳酸菌在GOLD階段通過增加疾病嚴重程度和GD1檢測采用χ2測試。gd1陽性和gd1陰性樣本的分析采用多重比較，並應用Bonferroni校正。所有其他數據均采用Student t檢驗進行顯著性檢驗。除非Bonferroni校正另有說明，否則p值<0.05被認為有統計學意義。進行多變量分析，如果p值低於0.05，則相關性為被認為是顯著的。
結果
qPCR檢測細菌總數和乳酸菌
在線補充表S3顯示了每個組織樣本在肺內的位置分解。肺上部、中部和下部三分之一的細菌總數沒有差異(p值在0.30至0.90之間;參見網上補充表S4和圖S3)。由於每個個體的兩個樣本之間沒有發現顯著差異，因此在所有後續分析中將它們平均在一起。基於總16S/100 ng DNA，兩組間無顯著差異(p>0.05)(見在線補充圖S4)。對照組平均為22.0±21 (mean±SD)， GOLD 1組為20.9±13.2,GOLD 2組為15.5±16.8 16S/100 ng。在使用任何藥物時，細菌總數也沒有差異(p>0.05;(見在線補充圖S5)或僅使用類固醇(數據未顯示)。
三組間的總比例無顯著性差異乳酸菌Bonferroni校正後(p>0.05;見網上補充圖S6)。占總數的百分比乳酸菌對照組為8.7%±15.0% (mean±SD)， GOLD 1組為2.5%±3.8%，GOLD 2組為8.1%±11.6%。的相對豐度沒有差異乳酸菌僅基於任何藥物使用或類固醇使用(數據未顯示)。此外，兩組在臨床特征(肺功能、吸煙史、年齡和性別)上無顯著差異乳酸菌,積極和乳酸菌,陰性個體(見在線補充表S5)。
PCR檢測GD1
初步數據顯示，產生gd1的流行率明顯下降乳酸菌與不吸煙和吸煙對照組相比，COPD GOLD 4肺組織的差異(p<0.05;圖1A).在早期COPD數據集中跟蹤這些數據，總共有5/74(7%)的樣本檢測出GD1基因陽性，其中4/5(80%)的個體也檢測出GD1基因陽性乳酸菌．隨著疾病嚴重程度的增加，GD1基因檢測呈陽性的個體顯著減少(p<0.05;圖1B).對照組中GD1陽性的個體總數為14%，而GOLD 1組和GOLD 2組分別為5%和0% (圖1B). GD1陽性組與GD1陰性組在類固醇使用、支氣管擴張劑使用或兩種藥物使用方麵無顯著差異(p>0.05)。
(A) GD1(甘油脫水酶)在初步數據集中的分布以百分比顯示;非吸煙者(n=8)、吸煙者(n=8)、慢性阻塞性肺疾病(COPD) GOLD 4 (n=8)組間p>0.05。(B)以百分比顯示的GD1分布。該圖顯示了對照組(GOLD 1和GOLD 2)中gd1陽性個體的百分比。
定量組織學
對於所有炎症細胞使用的最終Vv測量數據，對每個個體的兩個樣本進行平均。GOLD分級定量組織學結果的完整圖見在線補充圖S7。對所有Vv小氣道測量值及總細菌16S及總細菌百分比進行多因素分析乳酸菌CD1a+細胞的Vv與總細胞的比例相關乳酸菌(r = 0.27, p = 0.038;表2)．CD1a+樹突狀細胞與CD35+濾泡樹突狀細胞(r=0.39, p=0.009)和CD8+ T細胞(r=0.27, p=0.04)呈正相關。總16S細菌負荷與CD21+濾泡樹突狀細胞呈正相關(r=0.30, p=0.013;表2)．CD21+濾泡樹突狀細胞也與NK-1細胞呈正相關(r=0.32, p=0.013)。多變量分析中最強的相關性是CD4+ T細胞和CD68+巨噬細胞(r=0.44, p=0.001)。
然後研究gd1陽性和gd1陰性個體之間的炎症細胞Vv (圖2)．與gd1陰性組相比，gd1陽性組CD68+巨噬細胞和中性粒細胞的Vv顯著降低(p<0.0035;圖2B, C)。當隻分析對照樣本時，這種差異適用於CD68+巨噬細胞(見在線補充圖S8, p<0.05)，而中性粒細胞(PMN)則不適用(見在線補充圖S9, p>0.05)。使用類固醇(數據未顯示)或使用任何藥物(見在線補充圖S3)時，小氣道中的炎症細胞Vv沒有差異。
(A) GD1(甘油脫水酶)陽性和GD1陰性樣品中的炎症細胞體積分數。適應性免疫細胞Vv與GD1之間差異無統計學意義(p>0.05)。基於GD1陽性，巨噬細胞和中性粒細胞的Vv有顯著差異(p<0.0035)。(B) GD1陽性巨噬細胞的小氣道Vv (p<0.0035)。(C)小氣道Vv中性粒細胞GD1陽性(p<0.0035)。
討論
目前的結果證實了先前的報告，即對照組和COPD肺部微生物組中的細菌總數沒有差異，並通過顯示這適用於輕度至中度COPD組織來擴展它們。7，9它還表明，雖然在總數上沒有可檢測到的差異乳酸菌在對照組中，GOLD 1和GOLD 2在基因型組成上的差異乳酸菌可以在輕度和中度COPD患者的GD1陽性缺失中發現。此外,乳酸菌與CD1a+樹突細胞呈正相關，表明乳酸菌可能通過這些細胞影響宿主的反應。最後，本研究還表明，gd1陽性個體的巨噬細胞和中性粒細胞Vv低於gd1陰性個體。總的來說，這些數據支持gd1陽性的假設乳酸菌可能在COPD發病機製中具有抗炎作用。
由於Forsythe之前的一份報告，這些觀察結果特別有趣等，20.在對白蛋白敏感的小鼠中，口服gd1陽性治療這種l .與單獨用生理鹽水處理的對照組相比，在用白蛋白挑戰氣道之前，導致巨噬細胞和中性粒細胞浸潤到肺組織的減少，並降低了支氣管肺泡灌洗液(BAL)中的細胞和炎症介質含量。20.此外，這些研究人員隨後報告說，非特異性CD4 (+) CD25 (+) Foxp3(+)調節性T細胞對特定抗原的挑戰反應具有有效的免疫調節作用。21這些觀察結果清楚地表明了gd1陽性的可能性乳酸杆菌誘導能夠控製小鼠宿主免疫反應的免疫調節機製。通過調查，我們的研究建立在這些先前的觀察之上乳酸菌這與Forsythe的結果一致等的巨噬細胞和中性粒細胞數據。
調查的初步數據表明，與GOLD 1和GOLD 2級疾病一樣，GOLD 4在gd1陽性個體與對照組相比也有顯著降低。這意味著GD1陽性的降低發生在疾病的早期，可能是疾病進展中炎症增加的一個促成因素。3.更多的研究旨在進行調查乳酸菌將需要完成所有級別疾病的研究，以闡明該屬可影響COPD進展的真實範圍。
先前的研究表明CD8+ T細胞在COPD的進展中很重要。22CD1a+樹突狀細胞與CD8+ T細胞之間的相關性以及CD1a+樹突狀細胞與乳酸菌提供了這些細菌在COPD中發揮作用的可能機製。雖然，在早期COPD數據集中，與gd1陰性組相比，gd1陽性的巨噬細胞和中性粒細胞Vv顯著減少，但與巨噬細胞或中性粒細胞沒有相關性乳酸菌．這表明這些特異性炎症細胞與gd1陽性之間的作用乳酸菌可能不是簡單的線性相關，可能通過其他炎症細胞起作用。此外，CD1a+樹突狀細胞與其他在COPD中重要的主要細胞(巨噬細胞、CD4 T細胞和B細胞)不相關。3.，22，23這也意味著乳酸菌在疾病中可能不會直接影響這些細胞。然而，由於這項研究主要集中在早期COPD，有可能乳酸菌確實對疾病的後期有影響，但這項研究並不是為了研究這種可能的關係。
在這項研究中有一些重要的局限性需要被提及。首先，雖然gd1陽性組和gd1陰性組之間巨噬細胞和中性粒細胞的Vv顯著降低，但陽性樣本的總數相對較少，需要進行更大規模的研究來證實這些初步發現。有趣的是，本研究使用的初步數據集由來自個體的組織樣本組成，而不是早期COPD數據集中使用的組織樣本，並且在GD1陽性方麵顯示了一致的數據:隨著COPD嚴重程度的增加，GD1陽性顯著降低。其次，這些組織是從肺癌患者身上獲得的，即使這些組織是從遠離腫瘤的地方獲得的，但全球細菌負荷以及成分可能會受到影響。然而，沒有一個百分比的總數乳酸菌對照組、GOLD 1組和GOLD 2組的值超出了基於之前對肺組織中細菌微生物組的研究的預期範圍。9第三，盡管之前的研究表明，當使用類固醇時，細菌微生物群之間可能存在差異，24在該患者群體中使用類固醇的個體非常少(n=3)，對於本研究，類固醇可能對報道的結果沒有影響。第四，雖然分析了GD1，但在本研究中沒有直接測量reuterin, GD1陽性發揮抗炎作用的作用機製可能不是通過這一特定途徑。需要進行進一步的研究，旨在直接調查reuterin，以確認GD1通過這種抗生素在COPD中具有抗炎作用。此外，體外研究可能有助於闡明因果關係，因為這些發現隻是顯示了有趣的關聯。因果很難從這些類型的研究和GD1中區分出來乳酸菌可能隻是一個旁觀者，隨著炎症過程的發生而消失。
隨著越來越多關於細菌如何影響和改變我們的先天和適應性免疫係統的信息被了解，越來越明顯的是，許多細菌對我們的免疫係統有積極的影響。25雖然影響很小，但這些結果為gd1陽性的潛在益處提供了初步證據乳酸菌COPD的小氣道炎症未來的研究可能會表明它是有可能利用的乳酸菌將GD1基因作為臨床幹預措施，以幫助減輕炎症或作為輕中度COPD患者的預防措施。
參考文獻
補充材料
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補充數據
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本數據補充文件:
- 數據補充1-在線補充
腳注
貢獻者MAS負責實驗設計、數據分析並撰寫初稿;SU進行了實驗;MWE獲得了組織樣本;JCH構思了這項研究，並作出了智力貢獻;RGH構思了這項研究，獲得了組織樣本，並做出了智力貢獻。
資金該研究得到了默克外部研究協議iis38970 (UBC #F1038978)、NIH #HL084948和cihr# CIF-97687的支持。沒有任何機構參與研究設計;收集、分析和解釋數據;在該報告的書麵形式或在提交該報告以供出版的決定中。
相互競爭的利益一個也沒有。
倫理批準英屬哥倫比亞大學和聖保羅醫院。
出處和同行評審不是委托;外部同行評審。
數據共享聲明額外的數據可以通過Dryad數據存儲庫訪問http://datadryad.org/與doi: 10.5061 / dryad.pb830．