條文本
摘要
目標研究黏液蛋白MUC5B和MUC5AC作為攜帶表皮生長因子受體(表皮生長因子受體)突變。
設置1996年6月至2013年3月在日本長崎大學醫院及相關機構接受手術切除的患者。
參與者日本患者159例(男性:n=103;女性:n=56),非小細胞肺癌,手術切除(表皮生長因子受體-突變型:n=78,表皮生長因子受體野生型:n=81)。
結果腫瘤表達MUC5B的患者與MUC5B陰性患者相比,總生存期和無複發生存期顯著延長表皮生長因子受體突變NSCLC (p=0.0098和p=0.0187)。在患有表皮生長因子受體野生型NSCLC與MUC5B表達無相關性。MUC5AC表達在兩組間無差異表皮生長因子受體突變型和野生型NSCLC。
結論目前的研究結果表明,MUC5B,而不是MUC5AC,是一種新的預後生物標誌物攜帶NSCLC患者表皮生長因子受體但對攜帶野生型NSCLC患者無效表皮生長因子受體.
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數據來自Altmetric.com
本研究的優勢和局限性
非小細胞肺癌(NSCLC)中每個驅動突變的預後標誌物尚未確定。
MUC5B是表皮生長因子受體術後預後的有利標誌物(表皮生長因子受體)突變型NSCLC。
MUC5AC與術後預後無相關性表皮生長因子受體突變狀態。
MUC5B在表皮生長因子受體突變NSCLC仍然未知。
簡介
在美國和世界範圍內,肺癌是癌症相關死亡的主要原因。1非小細胞肺癌(NSCLC)約占所有肺癌的80-85%。1目前,不可切除NSCLC的靶向治療進展迅速,這是基於在表皮生長因子受體(表皮生長因子受體)和間變淋巴瘤激酶(ALK)融合。2,3.這些分子靶向治療已經揭示了與每個驅動突變相關的不同和/或重疊的致瘤途徑,特別是關於腫瘤複發的機製。4驅動突變的基因篩選,包括表皮生長因子受體突變和堿性融合,目前在轉移性NSCLC中很常見,但在手術切除的原發性NSCLC中不常見。5在煉金師肺癌試驗中(http://www.cancer.gov/researchandfunding/areas/clinical-trials/nctn/alchemist),即原發肺腫瘤攜帶表皮生長因子受體突變(表皮生長因子受體-突變患者)正在接受針對EGFR突變的厄洛替尼輔助治療的測試。然而,有利或不良的預後生物標誌物與表皮生長因子受體突變尚不清楚。這樣的生物標記物將有助於確定表皮生長因子受體-突變患者從厄洛替尼的輔助治療中獲益最大,而對無法獲益的患者術後避免這種不必要的治療。
最近,我們報道了Nkx2-1(也稱為TTF-1)在小鼠模型中的作用表皮生長因子受體突變的NSCLC減少了肺腫瘤的數量和大小,6並延長了小鼠的存活時間補充圖S1)。出乎意料的是,Nkx2-1誘導黏液蛋白MUC5B的表達,而不是MUC5AC表皮生長因子受體-突變的肺腫瘤6提示MUC5B可作為與腫瘤相關的有利預後標誌物表皮生長因子受體突變的NSCLC。在本研究中,我們評估了MUC5B在初步切除的腫瘤中是否表達表皮生長因子受體突變型或野生型肺腫瘤與患者術後生存有關。我們的研究提供了一種新的方法來評估患者的預後主要切除肺腫瘤攜帶表皮生長因子受體突變。
方法
研究人群
在1996年6月至2013年3月期間在長崎大學醫院及相關機構接受手術切除的患者中,檢測存在或不存在表皮生長因子受體本研究選擇了突變。的表皮生長因子受體內部或外部證實了突變(LSI Medience Corporation,日本)。我們進一步選擇了從患者圖表中檢索到臨床病理特征的患者,並在我們的機構和相關機構跟蹤其預後。我們納入159例患者(表皮生長因子受體-突變型:n=78,表皮生長因子受體野生型:n=81)表1).所有調查均由我們機構和相關機構的審查委員會批準,並在研究前獲得所有參與者的知情同意。
臨床病理的評價
根據WHO分類,NSCLC的組織學分為良、中度和低分化三種類型。7患者的中位隨訪期為1680天,從55天到4503天不等。對於所有患者,至少每6個月進行一次胸部x線檢查、CT掃描和腫瘤標誌物檢測,以確認是否有複發,即使患者沒有任何問題或症狀。
抗體信息
免疫組化染色使用一抗,濃度為:兔多克隆抗muc5b (1:200;sc-20 119, Santa Cruz Biotechnology)和兔muc5ac多克隆抗體(1:50;sc-20 118,聖克魯斯生物技術)。
樣品製備、選擇及免疫組化
5微米厚的福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)肺切片在二甲苯中脫蠟,並通過分級酒精係列脫水。為了獲取抗原,FFPE肺切片在121℃下10 mM檸檬酸(pH值6)中孵卵15分鍾,然後在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中洗滌。然後,將肺切片浸泡在3% H中2O2溶解30分鍾以阻斷內源性過氧化物酶,然後在4點與每個一抗孵育oC在一夜之間。PBS洗滌後,肺切片與過氧化物酶偶聯二抗(Simple Stain MAX-PO kit, Nichirei, Tokyo, Japan)在室溫下孵育30分鍾。對於免疫組化(IHC)染色,用二氨基聯苯胺(DAB:棕色)試劑盒(Histofine, Nichirei)觀察肺切片,並用H&E反染。DAB顯示的肺切片用酒精和二甲苯脫水,並以常規方式安裝。
所有病例均製備MUC5B中度表達的正常支氣管組織標本作為陽性對照。所有病例均製備MUC5AC中度表達的正常胃黏膜組織標本作為陽性對照。所有病例均作陰性對照。MUC5B和MUC5AC染色由兩名獨立訓練的觀察者(KW和TT)進行免疫組化評估。病理標準參照乳腺癌人表皮生長因子受體2 (Her2/neu)檢測指南確定(0分,未觀察到染色或<10%的腫瘤細胞細胞質染色不完全微弱/幾乎察覺;1分,10%的腫瘤細胞>細胞質染色不完全,微弱/幾乎察覺;評分2,腫瘤細胞>不完全弱/中度細胞質染色10%;3分,>30%的腫瘤細胞細胞質染色完整而強烈)。80分和1分被進一步歸類為陰性,2分和3分被進一步歸類為陽性。
統計分析
單變量分析,分類資料用χ進行分析2Fisher精確測試或Cochran-Armitage測試。連續數據用Mann-Whitney U檢驗或Kruskal-Wallis檢驗表示為平均值。采用Kaplan-Meier法計算總生存期(OS)和無複發生存期(RFS),采用log-rank檢驗檢驗組間差異的顯著性。未死亡或複發的參與者在最後一次隨訪時被審查。單因素的預後相關性由多因素Cox回歸分析確定。p值≤0.05被認為是顯著的。采用SPSS V.17軟件(SPSS Japan, Tokyo, Japan)進行分析。
結果
MUC5B和MUC5AC在非小細胞肺癌中的表達
由於MUC5B是一種豐富的細胞質和分泌蛋白,我們評估了MUC5B是否可以作為非小細胞肺癌攜帶患者的預後標誌物表皮生長因子受體原發性切除的人類肺腫瘤的突變。對原發切除的NSCLC腫瘤進行免疫組化檢測MUC5B的存在。78例NSCLC細胞中27例細胞質中檢測到MUC5B染色表皮生長因子受體81份樣本中有29份為野生型表皮生長因子受體(圖1A, B). NSCLC樣本也使用MUC5AC抗體進行檢測,在73個NSCLC樣本中的20個樣本中檢測到MUC5AC在NSCLC細胞細胞質中的表達表皮生長因子受體79個樣本中有24個是野生型表皮生長因子受體(圖1C, D)。這些結果表明MUC5B和MUC5AC在部分人類NSCLC中均有表達。
MUC5B或MUC5AC與表皮生長因子受體突變型或野生型NSCLC
MUC5B在非小細胞肺癌腫瘤中的表達表皮生長因子受體突變與臨床病理參數無相關性,包括年齡、性別、吸煙狀況、組織學類型、腫瘤大小、分化程度、分期、腫瘤狀態、淋巴結狀態、淋巴浸潤、靜脈浸潤或輔助化療(表2).MUC5B在野生型NSCLC腫瘤中的表達表皮生長因子受體與所有臨床病理參數不相關,但與組織學類型相關(見在線補充表S1)。
NSCLC攜帶患者的OS和RFS表皮生長因子受體突變或野生型表皮生長因子受體被評估。在一組被切除的非小細胞肺癌腫瘤攜帶表皮生長因子受體單因素分析顯示,OS中MUC5B的表達、腫瘤大小、組織學類型、分化程度、分期、淋巴浸潤和靜脈浸潤均有顯著性差異(p<0.05), RFS中MUC5B的表達、腫瘤大小、分化程度、分期、淋巴浸潤和靜脈浸潤均有顯著性差異(表3).在兩種OS中,腫瘤表達MUC5B的患者(MUC5B陽性患者)的生存時間明顯長於腫瘤不表達MUC5B的患者(MUC5B陰性患者)(5年OS;95.8% vs 65.1%, p=0.0098;圖2A)和RFS(5年RFS;69.9% vs 44%, p=0.0187;圖2B).采用單因素分析中p<0.05的變量進行多因素Cox回歸分析,MUC5B的表達與較好的OS和RFS獨立相關(p<0.05;表4).在切除的NSCLC腫瘤為野生型的患者隊列中表皮生長因子受體,單因素分析顯示,吸煙狀況、分期、靜脈浸潤和輔助化療的OS和RFS、淋巴浸潤和靜脈浸潤的OS差異有統計學意義(p<0.05)補充表S2)。muc5b陽性患者與muc5b陰性患者的OS和RFS無明顯差異(5年OS;59.5% vs 63.6%, 5年RFS;36% vs 48.5%,圖2C, D). NSCLC中MUC5AC的表達與OS和RFS無關表皮生長因子受體突變狀態(圖3).這些結果表明,MUC5B對於切除的NSCLC腫瘤攜帶的術後患者是一個有利的預後標誌物表皮生長因子受體突變,但沒有野生型-表皮生長因子受體.
討論
在本研究中,我們證實了MUC5B在原發性腫瘤中的表達表皮生長因子受體突變NSCLC與NSCLC患者更長的生存期相關。MUC5B,而不是MUC5AC,是人類攜帶NSCLC的有利預後生物標誌物表皮生長因子受體突變。我們的研究還表明,輔助化療對egfr突變患者無效,提示突變egfr靶向藥物,包括吉非替尼或埃洛替尼,應主要用於muc5b陰性的egfr突變患者,這些患者比muc5b陽性的egfr突變患者預後更差。我們使用MUC5B作為egfr突變患者的預後生物標誌物的結果應該整合到ALCHEMIST肺癌試驗中,以確定哪些患者將從輔助治療中受益最大。
在一些研究中,MUC5B已被評估為多種癌症的預後生物標誌物,使用逆轉錄- pcr、微陣列分析和免疫組化(見在線)補充表S3)。9-14評估MUC5B作為預後生物標誌物的信使RNA (mRNA)數據可在預後掃描數據庫中獲得,這是一個使用公開的微陣列數據對基因預後價值進行meta分析的數據庫。15MUC5B表達對預後的影響因癌症類型而異。在肺癌中,由預後掃描分析的六項微陣列研究均未表明MUC5B是一種良好或不良的預後生物標誌物。月16日免疫組化分析顯示MUC5B是一種預後不良的生物標誌物補充表S3),9,14這一發現與我們目前的研究相矛盾。之前的mRNA微陣列和免疫染色是基於所有nsclc而獨立於基於驅動突變的分類,這與我們的分析不同,我們的分析是基於分類的表皮生長因子受體突變。在兩項乳腺癌研究中,MUC5B作為預後因素的效用不同,這取決於腫瘤的分子基礎。在所有乳腺癌中,預後掃描顯示MUC5B與不良預後相關;22,23然而,在(雌激素受體-)陽性乳腺癌中,MUC5B與良好的預後相關,24表明腫瘤分子分類的潛在重要性。在本研究中,我們評估了MUC5B作為NSCLC的生物標誌物表皮生長因子受體突變狀態,而不是所有nsclc,確定MUC5B作為一個有利的預後生物標誌物表皮生長因子受體突變的非小細胞肺癌。
的監管MUC5B在表皮生長因子受體突變型NSCLC尚不清楚。MUC5AC而且MUC5B基因緊密地位於人類11號染色體上的一個位點上。兩者都是進化上保守的凝膠形成粘蛋白,由肺中的氣道上皮細胞分泌。在正常肺中,MUC5B的組成性表達水平高於MUC5AC。25在哮喘和其他肺部炎症性疾病中,MUC5AC在氣道杯狀細胞中高度誘導。25在特發性肺纖維化(IPF)中,氣道杯狀細胞高表達MUC5B而非MUC5AC。26,27該單核苷酸多態性(SNP) rs35705950位於MUC5B啟動子與誘導有關MUC5BIPF中的mRNA;27但在27例病例中,僅1例檢測到SNP rs35705950表皮生長因子受體表達MUC5B的突變NSCLC(數據未顯示),表明SNP與MUC5B的增加無關表皮生長因子受體突變的非小細胞肺癌。因為MUC5B在表皮生長因子受體肺腫瘤突變Nkx2-1雜合子小鼠(EGFRL858R;Nkx2-1+ /−),Muc5bNKX2-1在表皮生長因子受體突變NSCLC小鼠。6控製MUC5B基因不被理解表皮生長因子受體突變的NSCLC。MUC5B在癌症中的功能已經在MCF7乳腺癌細胞中使用截斷的MUC5B進行了分析,截斷的MUC5B促進MCF7細胞的腫瘤發生。13然而,使用截斷的MUC5B可能會掩蓋全長MUC5B的內在作用,因為有可能截斷的MUC5B可能以顯性-陰性的方式發揮作用。在肺部,MUC5B是粘液纖毛清除和對抗細菌感染的先天免疫所必需的。28MUC5B在肺癌中的潛在功能包括表皮生長因子受體突變型肺癌,目前還不清楚。目前的研究表明,MUC5B或過程調節MUC5B可能影響腫瘤的生長和轉移表皮生長因子受體突變的非小細胞肺癌。MUC5B可能作為一種替代生物標誌物,受與轉移和複發相關的途徑的影響表皮生長因子受體突變的非小細胞肺癌。
總之,我們的數據揭示了MUC5B在切除術中作為有利預後因素的臨床病理意義表皮生長因子受體突變的非小細胞肺癌。需要進一步的研究來闡明MUC5B的基因調控機製和功能表皮生長因子受體突變的非小細胞肺癌。
致謝
作者想要感謝患者,他們的家人,所有參與這項研究的研究人員,以及進行這項研究的中央實驗室表皮生長因子受體和Mary Durbin博士討論。
參考文獻
補充材料
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補充數據
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- 數據補充1-在線補充
腳注
貢獻者KW, TT, JAW, YM和TN參與了概念和設計。KW, TT, KTo, KTa, NY, KM, TM, AN, JAW和YM參與了研究材料的提供,患者和數據的獲取。KW、TT、KTo、KM、JAW、YM、TN參與數據分析和解釋。KW、TT、JAW、YM、TN負責稿件和知識內容的起草。
資金這項工作得到了日本文部科學省、國立衛生研究所、美國肺髒協會、辛辛那提大學博士後研究計劃和辛辛那提兒童醫院醫療中心的支持。
相互競爭的利益沒有宣布。
病人的同意獲得的。
倫理批準每個參與醫院的倫理委員會。
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