條文本
PDF
摘要
客觀的驗證下一代定向測序(NGS)平台- ion Torrent PGM喀斯特外顯子2和擴展拉福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)結直腸癌(CRC)標本的突變檢測，並與Sanger測序和ARMS-Scorpion real-time PCR進行比較。
設置北京,中國。
參與者回顧性隨機選取51個FFPE CRC存檔樣本(36名男性，15名女性)，然後由經驗豐富的病理學家根據CRC的組織學確認和足夠的組織可用性進行測序。
方法通過PGM分析、Sanger測序和Therascreen檢測，在51例FFPE CRC樣本中檢測到RAS突變喀斯特分別測定。評價3種方法的一致性。通過對已知突變狀態的FFPE細胞係連續稀釋的DNA測序進一步確定測定靈敏度。
結果51例中13例(25.5%)發生基因突變喀斯特外顯子2，由PGM分析確定。PGM檢測與Sanger測序(κ=1.000, 95% CI 1 ~ 1)的符合性為100%(51/51)，與Therascreen檢測(κ=0.947, 95% CI 0.844 ~ 1)的符合性為98.04% (50/51)喀斯特外顯子2突變。唯一不一致的情況是喀斯特Therascreen試劑盒未檢測到外顯子2突變(c.37G>T)。稀釋級數實驗結果表明，PGM能有效檢測喀斯特突變頻率低至1%。重要的是,拉其他突變喀斯特PGM檢測到10例標本外顯子2突變。此外，PGM可以在一次測試中同時檢測到其他crc相關基因的突變。
結論目標NGS平台是特定的和敏感的喀斯特外顯子2突變檢測，適用於常規臨床檢測。此外，該方法節省樣本，節省成本和時間，在臨床應用中有很大的潛力，可以將檢測擴大到包括突變拉以及其他與crc相關的基因。
這是一篇開放獲取文章，根據創作共用屬性非商業(CC BY-NC 4.0)許可證發布，該許可證允許其他人以非商業方式分發、混音、改編、在此作品的基礎上進行構建，並以不同的條款許可其衍生作品，前提是原始作品被正確引用且使用是非商業性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/
數據來自Altmetric.com
本研究的優勢和局限性
這是第一個評估靶向下一代測序(NGS)平台-Ion Torrent PGM和Ion AmpliSeq癌症熱點麵板擴展的研究拉福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)結直腸癌(CRC)標本突變檢測。
我們的結果突出了目標NGS平台的優勢-離子激流PGM喀斯特外顯子2和擴展拉FFPE CRC標本的突變檢測，並與Sanger測序和ARMS-Scorpion real-time PCR進行比較。
這項研究受到樣本量相對較小的限製。
介紹
我們正在接近一個個性化和精準醫療的時代，癌症診斷和治療將根據每個患者獨特的基因特征量身定製。表皮生長因子受體(EGFR)在包括結直腸癌(CRC)在內的許多實體癌的生長和生存中起著重要作用。1抗egfr治療已被證明在轉移性CRC患者中有效。鑒於隻有一小部分轉移性結腸癌患者對西妥昔單抗有反應，預測患者對抗egfr治療的反應對於避免副作用和節省成本是必要的。2RAS蛋白(HRAS, KRAS和NRAS)是重要的下遊效應物，通過從非活性的gdp結合形式循環到活性的gtp結合形式，將信號從細胞表麵受體(包括EGFR)傳遞到細胞內信號級聯。的喀斯特吉恩是拉在CRC中，大約35-45%的CRC發生突變，在CRC的外顯子2的密碼子12和13中發生突變喀斯特基因使GTPase對GAP刺激不敏感，導致該蛋白以gtp結合形式的組成性激活。3.這是眾所周知的病人喀斯特-突變的CRC對抗egfr藥物(西妥昔單抗/帕尼單抗)的治療有耐藥性喀斯特激活突變發生在EGFR下遊。喀斯特已被證實為抗egfr治療CRC療效的預測生物標誌物。3.出於這個原因，喀斯特突變檢測越來越多地被推薦用於選擇CRC患者接受抗egfr治療。4，5測試喀斯特自2008年以來，外顯子2突變已被添加到國家綜合癌症網絡(NCCN)結腸癌臨床實踐指南中。此外,擴展喀斯特外顯子2測試包括拉已在最新的NCCN結腸癌指南(V.2.2015)中推薦。
目前有許多基於測序和pcr的技術可用喀斯特突變檢測在臨床實踐中，各有特定的優點和局限性。2，6，7傳統的Sanger測序由於其低假陽性率和高特異性，多年來一直被認為是識別突變的金標準。然而，該方法靈敏度低，而且需要手動分析測序色譜圖來搜索突變，耗時較長。的Therascreen喀斯特突變試劑盒(Qiagen, Hilden, Germany)已開發用於執行實時，等位基因特異性檢測(PCR)，使用Scorpion ARMS技術檢測最常見的喀斯特密碼子12和13的突變。與Sanger測序相比，它在檢測低水平突變方麵具有更高的敏感性，並已獲得美國食品和藥物管理局(FDA)的批準喀斯特福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)結直腸癌組織DNA突變檢測。8然而，Therascreen試驗設計僅用於檢測細胞外顯子2中的特定體細胞突變喀斯特致癌基因。9此外，傳統的擴展方法成本高、耗時長拉突變或多重基因檢測。
近年來，快速的技術進步將下一代測序(NGS)的應用從研究擴展到臨床測試。10NGS為臨床環境下的基因畸變檢測提供了一個經濟、高靈敏度和高通量的平台。11正如我們所知，最近更新的NCCN指南強烈建議對所有轉移性CRC患者的腫瘤組織(原發腫瘤或轉移)進行基因分型拉（喀斯特外顯子2和非外顯子2國家管製當局方麵)，以及患有任何已知喀斯特或國家管製當局方麵突變不應用西妥昔單抗或帕尼單抗治療。鑒於傳統檢測方法存在樣本低、成本低、時間低的問題，NGS平台在FFPE CRC標本的多重基因檢測方麵具有巨大的臨床應用潛力。目前，一些NGS平台已經商業化，可用於目標基因組區域或全基因組/外顯子組的測序，以分析各種疾病相關的遺傳改變，如點突變、插入、缺失和拷貝數變化。12然而，NGS在臨床腫瘤學中的常規應用仍處於起步階段。11Ion Torrent PGM是一種很有前途的基因測序平台;它已經證明了高生產力和性能，並顯示出臨床前景，特別是在檢測單核苷酸變異(SNVs)方麵。13 - 15雖然有其他研究比較NGS平台和其他方法，離子激流PGM的潛在臨床應用為確定拉FFPE CRC樣本中的突變狀態尚未得到很好的研究，基於最新的NCCN CRC指南，這尤其有意義。因此，在本研究中，我們旨在分析其檢測的性能喀斯特在敏感性和特異性方麵，與目前臨床實踐中使用的另外兩種方法雙向Sanger測序和Therascreen進行了比較喀斯特並探討其潛在的臨床應用推廣拉突變檢測。
方法
樣本量計算
我們的樣本量計算是基於下麵Karimollah所描述的公式16：
敏感性(或特異性)是由先前發表的數據或臨床醫生的經驗/判斷確定的預定值;α為統計判斷的置信水平，其中α為第一類錯誤的概率;α= 0.05,
= 1.96;D為估計靈敏度(或特異性)的精度，即估計靈敏度(或特異性)與真實值之間的最大差值。在我們的研究中，敏感性和特異性的預定值分別為99%和98%，
=1.96，誤差範圍(d)設置為±5%，得到的結果將精確到±5個百分點以內。根據公式，敏感性和特異性樣本量分別為15和30。隨後，敏感性和特異性的總樣本量分別用以下公式計算:
Prev表示疾病在人群中的流行程度。在我們的本研究中，疾病在人群中的患病率為40%，因此根據敏感性和特異性計算的總樣本量分別為38.0和50.2。基於敏感性和特異性的最大參與人數為50.2，因此我們的研究最終選擇了51個樣本量。
組織樣本和細胞係
從2014年1月至2015年3月北京協和醫院外科病理檔案中回顧性檢索了51例FFPE CRC患者的存檔樣本(包括43例原發性病灶和8例轉移性病灶)。采用簡單隨機抽樣，基於Microsoft Excel生成的隨機數進行案例選擇，避免樣本選擇偏差。這些樣本(36個手術標本和15個活檢標本)由一位經驗豐富的病理學家檢查測序，基於結直腸腺癌的組織學確認和執行三種方法所需的足夠FFPE腫瘤組織的可用性。獲得患者知情同意。
從ATCC中獲得胰腺細胞株Panc-1和BxPC-3。使用與組織樣本相同的方法將它們固定並嵌入。
DNA提取
有經驗的病理學家選擇含有腫瘤組織的合適石蠟塊進行分析，並回顧了h&e染色切片。在h&e染色的載玻片上標記腫瘤區域，然後手動從多達10個未染色切片(5毫米厚)進行宏觀解剖，以富集腫瘤細胞，然後提取DNA。腫瘤細胞含量為60% ~ 95%，中位細胞數為80%。使用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen)進行DNA分離。同樣的DNA提取方法用於FFPE細胞係。然後使用Qubit dsDNA BR法(Life Technologies, Gaithersburg, USA)對提取的DNA進行定量。
離子流PGM測序和數據處理
總共使用10 ng DNA作為模板生成擴增子文庫進行測序。使用Ion AmpliSeq Library Kit 2.0和Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 (Life Technologies)製備了文庫，該文庫擴增了207個擴增子，涵蓋50個癌基因和腫瘤抑製基因中的約2800個COSMIC突變，覆蓋範圍廣泛拉（喀斯特，國家管製當局方麵和極品)和其他crc相關基因(BRAF，TP53APC, MLH1, PIK3CA, SMAD4, FBWX7等)。根據製造商的方案進行適配器結紮、缺口修複和PCR擴增。然後使用量子比特dsDNA HS檢測試劑盒和量子比特2.0熒光計(Life Technologies)對文庫進行量化。接下來，將它們分別稀釋到3ng /mL的濃度，並以等體積混合。乳液PCR和富集步驟使用Ion OneTouch模板試劑盒和Ion OneTouch係統(Life Technologies)進行，根據製造商的協議。富集後，擴增子庫使用Ion Torrent PGM係統(Life Technologies)進行測序，使用314芯片，使用Ion Xpress條形碼適配器1-16 Kit (Life Technologies)進行條形碼。測序後，使用Torrent Mapping Alignment Program (TMAP)將讀數映射到參考基因組(hg19)。300000個AQ20讀數的截斷值被用作314芯片上成功測序的衡量標準。變體是使用Torrent Variant Caller識別的(3.6.6;生命技術)。 A sequencing coverage of 200X was used as the minimum requirement to verify the authenticity of sequence variants. Integrative Genomics Viewer (Broad Institute, Massachusetts, USA) was used to visualise variants aligned against the reference genome to confirm the accuracy of the variant calls by checking for possible strand biases and sequencing errors.
ARMS/Scorpion實時PCR
一個Therascreen喀斯特根據製造商的說明使用突變試劑盒(Qiagen)。該試驗旨在檢測一種野生型對照和七種最常見的病毒喀斯特外顯子2的密碼子12和13突變表1。實時PCR在轉子基因Q實時PCR平台(Qiagen)上進行。質量控製運行和突變分析的循環條件如下:在95°C下15 min，然後在95°C下30 s和60°C下1 min循環40次。在60°C下測量熒光。各突變數據經曲線分析和ΔCt值計算後，按試劑盒說明書解釋。
桑格測序
拉使用中指定的引物，采用基於pcr的2×雙向直接Sanger測序方法檢測突變表2。測序結果使用Chromas軟件V.1.45 (Technelysium Pty, Helensvale, Australia)進行解釋。
檢測靈敏度
已知人胰腺癌細胞係Panc-1含有雜合子喀斯特p.G12D (c.35G>A)突變和純合子TP53p.R273H (c.818G>A)突變，而BxPC-3在這兩個位點均無突變。測定SNV檢測的敏感性是通過從兩個細胞係分離的連續稀釋DNA測序確定的。將FFPE Panc-1 DNA與FFPE BxPC-3 DNA按1:0、1:1、1:4、1:9、1:19、1:49、1:99 (Panc-1:BxPC-3)的比例混合，分別稀釋100%、50%、20%、10%、5%、2%、1%。
統計分析
以95% CI的κ係數評價兩種檢測方法的一致性。使用SPSS軟件for windows, V.20 (SPSS公司，芝加哥，伊利諾伊州，美國)進行分析。
結果
檢測喀斯特三種方法檢測51例FFPE CRC標本外顯子2突變
回顧性收集2014年1月至2015年3月共51份樣本。患者包括36名男性和15名女性，中位年齡63.0歲(範圍:41-87歲)。在51個樣本中，13個(25.5%)的外顯子2發生突變喀斯特，由Ion Torrent PGM NGS測定，覆蓋範圍為369X至2110X，變異頻率為22.2至59.1% (表3和圖1a - c)。a的樣本數喀斯特Sanger測序檢測到的外顯子2突變為13/51 (25.5%)，Therascreen法檢測到的突變為12/51(23.5%)。Ion Torrent PGM分析與Sanger測序結果一致100%喀斯特Ion Torrent PGM/Sanger測序與Therascreen real-time PCR的一致性較高(κ=0.947, 95% CI 0.844 ~ 1)，兩種方法之間僅1例結果不一致(1/51)(表3和圖1D-F)。這個差異病例(病例37)有一個特定的突變(c.37G>T)，沒有被覆蓋，因此不能被Therascreen檢測到喀斯特裝備。
分別用Ion Torrent PGM、Sanger測序(反向測序)和Therascreen法檢測病例24 (A-C)和病例37 (D-F)中的KRAS外顯子2突變。
使用FFPE細胞係檢測敏感性
為了進一步比較Ion Torrent PGM和Sanger測序對SNV測試的敏感性，我們使用FFPE人類胰腺癌細胞係在兩個位點進行了稀釋係列實驗，已知突變狀態(喀斯特密碼子12和TP53密碼子273)，如方法部分所述。我們的結果表明，Ion Torrent PGM測序能夠檢測到喀斯特突變(c.35G>A)水平低至1%，而Sanger測序數據難以解釋稀釋(Panc-1: BxPC-3)低於10% (表4，圖2f和3.f)。得到了類似的結果TP53突變(c.818G>A)檢測(數據未顯示)。我們的結果證實了Ion Torrent PGM與Sanger測序相比具有更高的敏感性。此外，我們的結果表明，離子激流PGM可以檢測喀斯特突變(c.35G>A)，線性良好(R2= 0.97) (圖4A).也有很強的相關性(R2的稀釋度(期望突變頻率)與計算突變頻率之間=0.97)TP53突變(c.818G>A)檢測(圖4B).然而，當稀釋/預期變異頻率低於5%時，相關性變得較弱，可能是由於基線變異。
檢測喀斯特用Ion Torrent PGM (A -f:分別稀釋50%，20%，10%，5%，2%和1%)從福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)人類胰腺癌細胞係中分離的序列稀釋DNA中檢測到突變p.G12D (c.35G>A)。
檢測喀斯特通過Sanger測序(前向測序)(A -f:分別稀釋50%、20%、10%、5%、2%和1%)，從福爾曼固定石蠟包埋(FFPE)人類胰腺癌細胞係中分離到的序列稀釋DNA中發現p.G12D (c.35G>A)突變。
稀釋和計算突變頻率之間的線性稀釋係列實驗執行使用離子洪流PGM。
離子激流PGM的應用前景廣闊拉FFPE CRC樣本分析
我們還探討了Ion Torrent PGM平台的擴展應用潛力拉分析。共10例有A拉a以外的突變喀斯特外顯子2突變(非外顯子2喀斯特突變,國家管製當局方麵)，覆蓋範圍為462X ~ 2420X，變異頻率為14.3% ~ 66.4%，分別占全部病例的19.6%(10/51)和26.3% (10/38)喀斯特外顯子2野生型病例。在這些額外的拉突變，3例攜帶a喀斯特外顯子3突變，6個懷有一個喀斯特外顯子4突變1例國家管製當局方麵外顯子3突變，分別(表5)。所有這些突變均經Sanger測序證實(圖5f)。然而，通過Sanger測序檢測低頻突變相對困難(圖6A、B)。
其他檢測拉病例28 (A和B)、病例50 (C和D)和病例47 (E和F)分別通過Ion Torrent PGM和Sanger測序(反向測序)檢測到突變。
檢測喀斯特Ion Torrent PGM和Sanger測序(反向測序)分別顯示，病例40的外顯子4突變頻率相對較低(14.3%)。
此外，其他crc相關基因(BRAF，TP53Ion Torrent PGM同時檢測APC、MLH1、PIK3CA、SMAD4、FBWX7等基因補充附件圖S1)。
討論
喀斯特在考慮對轉移性CRC患者進行抗egfr治療時，突變狀態是至關重要的。雖然目前有許多方法用於測試檔案FFPE樣本喀斯特在臨床實踐中，NGS在這方麵的可行性還沒有很好地建立。最近的幾項研究表明，用454或Illumina NGS技術獲得的結果與標準測定法之間具有很高的一致性喀斯特突變檢測，在新鮮冷凍和FFPE組織。6，7，17，18Ion Torrent PGM是一種新型的、基於半導體的、易於操作的台式NGS平台。由於其相對較低的數據輸出和快速的周轉時間，Ion Torrent PGM是較小的，重點測序項目的理想選擇(例如，靶向基因測序)，因此，它很可能獲得臨床相關性。10在這項研究中，我們評估了Ion Torrent PGM和一個現成的靶向癌症基因麵板(Ion AmpliSeq cancer Hotspot panel v2)的性能喀斯特51例FFPE結直腸腺癌標本的突變情況。典型的Sanger敏感性限製在大約15%，NGS技術被認為比Sanger測序更敏感。6在我們的51例病例中，Ion Torrent PGM分析與Sanger測序結果一致100%喀斯特外顯子2突變檢測。這一發現可能是由於使用組織學引導的宏觀解剖來富集腫瘤細胞，在我們的研究中，最低變異頻率為22.2%。為了進一步檢驗Ion Torrent PGM檢測低頻變異的敏感性，我們使用FFPE人胰腺癌細胞係進行了稀釋係列實驗，已知突變狀態。我們的結果表明，Ion Torrent PGM能夠以良好的線性度檢測不同速率的snv，比Sanger測序更敏感。盡管Therascreen檢測也被認為比Sanger測序更敏感，但它被設計為僅檢測7個特定的體細胞突變的外顯子2喀斯特癌基因，因此可能產生假陰性結果喀斯特外顯子2檢測。9，19在我們的研究中，Therascreen檢測結果與NGS/Sanger測序結果的一致性為98.04%(50/51)。有一例c.37G>T突變不在檢查的7個特異突變之列，Therascreen檢測沒有檢測到。總的來說，我們的結果表明，Ion Torrent PGM是特異性和敏感的喀斯特與Sanger測序和Therascreen檢測相比，FFPE CRC樣本中的外顯子2突變檢測是合適的，適用於常規臨床檢測。此外，Ion Torrent PGM提供了傳統方法無法獲得的可變頻率信息。與我們的結果一致，在之前的研究中，Ion Torrent PGM已被證明是一種可靠的突變篩查方法，可用於其他腫瘤類型的SNV檢測。17，20.
雖然喀斯特外顯子2突變預測轉移性CRC患者對抗egfr治療缺乏反應，該基因沒有突變並不能保證抗egfr單克隆抗體(mAb)的治療反應。最近的幾項研究揭示了其他拉突變(在喀斯特外顯子3和4國家管製當局方麵外顯子2、3和4)也可能預測抗egfr抗體治療耐藥性。4，21鑒於此，擴展測試拉基因突變，包括喀斯特外顯子2突變等拉在最新的NCCN結腸癌臨床實踐指南中推薦。在我們的研究中，Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2被用於Ion Torrent PGM測序，它能夠廣泛覆蓋腫瘤喀斯特，國家管製當局方麵和極品基因，從而實現擴張喀斯特包括外顯子2突變檢測拉突變。因此，相當比例的患者拉在我們的野生型中發現了突變喀斯特外顯子2患者(10/ 38,26.3%)采用Ion Torrent PGM檢測。這些患者也不太可能從抗egfr單抗治療中顯著受益。在之前的研究中，在拉突變之外喀斯特外顯子2突變喀斯特外顯子4在結直腸癌患者中最為常見。喀斯特外顯子4突變在氨基酸殘基K117和A146上被檢測到喀斯特外顯子4突變的患者喀斯特外顯子2野生型腫瘤的比例從3.7%到9.3%不等。4考慮到喀斯特密碼子117突變在一些研究中沒有被評估，實際發病率喀斯特外顯子4突變可能被低估了。4，22我們還發現了外顯子4喀斯特在51例病例中，K117和A146位點發生突變(19例A146T, 1例A146V和3例K117N)，頻率較高(11.8%，6/51)。由於我們的樣本量較小，因此應謹慎考慮，並值得在更大的研究中進一步探索。此外，Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2被設計用於針對50個癌基因和腫瘤抑製基因的“熱點”區域(Braf, tp53, apc, mlh1, pik3ca, smad4, fbwx7，等)，從而能夠同時檢測其他CRC相關基因突變，並提供與CRC腫瘤發生、預後和治療耐藥性密切相關的額外遺傳信息。結果表明，離子激流PGM是一種合適的擴展劑拉在FFPE CRC樣本中進行突變檢測，具有很大的臨床應用潛力。
重要的是，我們用於Ion Torrent PGM測序的檢測板包含207對引物在一個試管中，隻需要10 ng的FFPE DNA作為模板，可以同時檢測一個基因的多個變體或在高度有限的樣本中(如活檢和細針穿刺)的多個基因，促進了多個基因和變體的成本效益和時間效益測序。相比之下，桑格測序和PCR需要幾微克的DNA來檢測特定區域內的遺傳改變。15因此，活檢標本可能不足以使用這兩種方法進行多種基因檢測。更糟糕的是，需要進行多個單獨的測試會增加時間和成本。此外，Ion Torrent PGM數據可以通過Torrent Suite軟件和Ion Reporter軟件自動分析和注釋，而Sanger測序數據的分析和解釋需要手動檢查每個基因區域的測序色譜圖，因此非常耗時。正如我們的研究所證明的那樣，識別桑格測序色譜圖中低頻出現的變異是特別困難的。因此，Ion Torrent PGM是在CRC中進行多重基因檢測的一個節省樣本、成本效益和時間效率的平台。鑒於本研究中很少有病例出現低頻突變，有必要進行更大規模的研究，以進一步評估Ion Torrent PGM檢測低頻突變的臨床應用。
結論
綜上所述，我們比較了三種檢測方法的使用情況喀斯特51例FFPE CRC標本突變。離子激流PGM對其有較強的特異性和敏感性喀斯特外顯子2突變檢測比Sanger測序和Therascreen檢測結果好，適合用於常規臨床檢測。此外，Ion Torrent PGM是一種節省樣本、節省成本和時間的CRC多重基因檢測平台，在臨床應用中顯示出巨大的潛力，將檢測擴展到包括突變拉以及其他與crc相關的基因。
參考文獻
腳注
JG和HW的貢獻相當。
貢獻者JG和HW進行了研究，分析了數據並起草了手稿。HW和HZ參與組織學檢查。ZL設計了本次研究，同時也是稿件的主要編輯。LW, HD和JL對手稿進行了審查和嚴格的修改。所有的作者都閱讀並批準了最終的手稿。
資金國家衛生和計劃生育委員會公益科學研究專項基金(201402001)資助。
相互競爭的利益沒有宣布。
倫理批準本研究得到北京協和醫院機構評審委員會的批準。
出處和同行評審不是委托;外部同行評審。
數據共享聲明其他數據可以通過Dryad數據存儲庫訪問http://datadryad.org/與doi: 10.5061 / dryad.3447g。