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摘要
簡介化療複發或難治性CD19+ B細胞來源的急性淋巴細胞白血病(r/r B- all)患者沒有治愈性治療。雖然cd19靶向的第二代(2 -g)嵌合抗原受體(CAR)修飾的T細胞攜帶CD28或4-1BB結構域在晚期B-ALL患者中表現出效力，但這兩種信號結構域賦予CAR-T細胞不同的和互補的功能特性。臨床前結果表明，結合4-1BB和CD28信號結構域的第三代(3rd-G) CAR-T細胞與攜帶CD28結構域的2代car -g CAR-T細胞相比，具有更好的激活和增殖能力。因此，當前研究的目的是調查3d - g CAR-T細胞在成人r/r B-ALL患者中的安全性和有效性。
方法與分析這項研究是針對r/r B-ALL患者的I期臨床試驗，旨在測試3 - g CAR-T細胞的安全性和初步療效。在接受淋巴消耗調理方案之前，符合條件的患者的外周血單個核細胞將被白細胞清除，T細胞將被純化、激活、轉導和體外擴增。在方案的第6天，單劑量每公斤100萬個CAR-T細胞將通過靜脈注射。分別使用流式細胞儀、實時定量PCR和流式細胞珠陣列技術檢測CAR- t輸注後2年內CAR- t細胞的表型、CAR轉基因拷貝數和血漿細胞因子。此外，幾種與嚴重細胞因子釋放綜合征(CRS)高度相關的預測血漿細胞因子，包括幹擾素-γ、白細胞介素(IL)-6、IL-8、可溶性白細胞介素(sIL)-2R-α、可溶性糖蛋白(sgp)130、sIL- 6r、單核細胞趨化蛋白(MCP1)、巨噬細胞炎症蛋白(MIP1)-α、MIP1-β和粒細胞-巨噬細胞集中性刺激因子(GM-CSF)，將被用於預測CRS，以便進行早期幹預。CRS將根據修訂後的CRS評分製度進行管理。此外，3級或4級神經毒性或持續性b細胞再生障礙者將分別接受地塞米鬆(每6小時靜脈注射10mg)或IgG治療。將進行描述性和分析性分析。
倫理與傳播該研究於2014年7月10日獲得倫理批準(YLJS-2014-7-10)。所有參與者將獲得書麵知情同意。研究結果將通過同行評審期刊、會議報告和內部組織報告進行報告。
試用注冊號NCT02186860．
- 免疫學
- 嵌合抗原受體
- 急性淋巴細胞白血病
- 第三代
這是一篇開放獲取文章，根據創作共用屬性非商業(CC BY-NC 4.0)許可證發布，該許可證允許其他人以非商業方式分發、混音、改編、在此作品的基礎上進行構建，並以不同的條款許可其衍生作品，前提是原始作品被正確引用且使用是非商業性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/
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本研究的優勢和局限性
慢病毒修飾的cd19靶向第三代(3rd-G)嵌合抗原受體(CAR)-T細胞首次用於治療成人r/r B細胞來源的急性淋巴細胞白血病。
采用24種預測重度細胞因子釋放綜合征(CRS)的血漿細胞因子來預測CRS的發展，並采用修訂的CRS分級係統來管理重度CRS。
這項研究的目的不是比較第三代-g CAR-T細胞與第二代細胞的安全性和有效性。
簡介
急性淋巴細胞白血病
急性淋巴母細胞白血病(ALL)是一種高度異質性的疾病，根據免疫表型分為三組，包括B細胞源性白血病(B-ALL)、T細胞源性白血病和混合譜係急性白血病。其中以B-ALL(∼74%)最多，包括早期pre-B-ALL(∼10%)、普通ALL(∼50%)、pre-B-ALL(∼10%)、成熟B-ALL(∼4%)。盡管B-ALL發生於兒童和成人，但兩組患者的預後有所不同。兒童B-ALL的5年生存率增加到80%以上，而成人的預後則不樂觀。1許多高危病例和特殊亞組(如r/r B-ALL)仍然缺乏有效的治療。此外，臨床醫生在治療化療副作用引起的嚴重並發症方麵麵臨巨大挑戰。因此，迫切需要創新方法進一步提高r/r成人B-ALL的治愈率和改善生活質量。
嵌合抗原受體修飾的T細胞
癌症免疫治療試圖利用免疫係統的力量和特異性來對抗癌症，並取得了五項重大突破(sipuleucel-T, ipilimumab, nivolumab, pembrolizumab和atezolizumab)。2 - 7日T細胞作為一種有吸引力的免疫治療介質，對癌細胞的植入和生長具有特異性的抑製作用。8
大量研究表明，它們的完全有效激活需要三個信號，包括t細胞受體接合(信號1)、共刺激(信號2)和細胞因子刺激(信號3)。9然而，b係惡性腫瘤，例如B-ALL，由於缺乏兩種主要t細胞共刺激分子CD28或4-1BB的配體，通常缺乏信號2。這些配體的缺乏導致T細胞在刺激後迅速凋亡和B-ALL細胞的免疫逃逸。10，11因此，通過基因工程將信號1和2整合到T細胞上表達的一種功能蛋白(如嵌合抗原受體(CAR))中，有助於解決B-ALL的這些問題，CAR-T治療已成為治療B-ALL患者的一種有前途的策略。
我們都知道，CAR-T療法利用抗體特異性、歸巢、組織穿透和T細胞的靶標破壞來對抗癌症。它有以下兩個優點。一方麵，CAR的功能不依賴於人類白細胞抗原(HLA)分子，它有助於克服HLA I類分子的下調，這是腫瘤免疫逃逸機製之一;另一方麵，CAR的靶點選擇並不局限於蛋白質抗原。1989年，以色列免疫學家Zelig Eshhar首次報道了CAR-T細胞原型，用於研究主要組織相容性複合體(MHC)分子在t細胞激活中的作用。12然而，由於第一代CAR- t細胞在體內的持久性較差，隨後的臨床結果令人失望，促使CD28、4-1BB、CD134或誘導共刺激因子的共刺激信號域納入CAR細胞內結構。11，13，14這些結構域的合並顯著提高了CAR-T在臨床前和臨床研究中的持久性，並在B細胞源性腫瘤患者中取得了有希望的結果，特別是使用攜帶CD28或4-1BB信號結構域的第二代(2 -g) CAR-T治療的B- all患者。表1)．然而，這兩個結構域決定了CAR-T細胞的不同功能特性，例如，基於cd28的car直接具有抗腫瘤效力，而基於4- 1bb的car具有長期持久性的能力。34結合4-1BB和CD28信號結構域的第三代CARs (3rd-G)對T細胞具有這兩種不同的功能特性嗎?盡管臨床前研究表明，3d - g CAR-T細胞的激活狀態高於2d - g，35目前還沒有臨床證據表明使用它們來治療B-ALL患者。因此，I期臨床試驗將使用抗cd19 3 - g CAR-T細胞治療r/r B-ALL。
方法
研究設計
I期臨床試驗(ClinicalTrial.gov編號:NCT02186860)將用於評估抗cd19 3 - g CAR-T細胞在r/r B-ALL患者中的安全性和有效性。我們計劃從我們的臨床數據庫中招募5名患者參與本試驗，關鍵的納入和排除標準見箱1．一般協議方案和抗cd19 3 - g CAR結構如圖所示圖1而且2,分別。
本研究的主要納入和排除標準
入選標準:
免疫組化和流式細胞術證實CD19+ B細胞源性急性淋巴母細胞白血病;
化療複發或難治性，複發定義為首次或更多次骨髓複發，難治性定義為在標準化療方案兩個周期後未實現完全緩解(形態學<5%母細胞);
男女患者年齡18-65歲;
沒有可用的治療方案(如造血幹細胞移植);
充分的器官功能定義為:肌酐<2.5 mg/dL，天門冬氨酸轉氨酶-丙氨酸轉氨酶比值<3×upper正常範圍極限，膽紅素<2.0 mg/dL;
卡爾諾夫斯基性能狀態≥60;
預期生存時間>3個月;
有足夠的靜脈通路進行單采;
理解並給予知情同意的能力;
可測量的骨髓形態學疾病(≥5%的母細胞)。
排除標準:
孕婦或哺乳期婦女;
需要t細胞免疫抑製治療的患者;
活動性中樞神經係統白血病;
任何同時活躍的惡性腫瘤;
有癲癇或心髒疾病病史的患者;
既往使用過任何免疫治療產品;
艾滋病毒、乙型或丙型肝炎感染患者;
患者接受造血幹細胞移植;
不受控製的活動性感染。
一般的學習模式。CAR，嵌合抗原受體;PBMC，外周血單個核細胞。
抗cd19 3 - g CAR結構，包括FMC63單鏈可變片段(scFv)， CD8α鉸鏈和跨膜，CD28和4-1BB信號域，cd3 ζ。3 rd-g,第三代;CAR，嵌合抗原受體。
簡而言之，從符合條件的參與者中提取足夠的外周血單個核細胞(pmcs)用於CAR- t的生產，並在第0天和第4天檢測血漿中CAR轉基因和細胞因子的基線拷貝數。這些T細胞將被純化，用慢病毒表達的抗cd19 3 - g CAR轉導，並在體外用白細胞介素(IL)-7和IL-15擴增。在第1-3天，患者將接受由環磷酰胺(1000mg /m)組成的淋巴消耗調理方案2×1 day)和氟達拉濱(35mg /m2×3天)CAR-T輸注前。所有參與者將在第6天接受每公斤100萬個CAR-T細胞的單次輸注。靜脈輸注CAR- t細胞後，在第7-33天檢測血漿中輸注CAR- t細胞的表型、CAR轉基因和細胞因子的拷貝數。第28天，骨髓抽吸及活檢。第33天後，每月進行一次觀察和監測，直至CAR-T細胞輸注後6個月。然後，每季度進行同樣的觀察和監測，直到CAR-T輸注後2年。
FMC63作為CD19抗原結合域。CD8α鉸鏈結構域有助於結合CD19抗原，CD19抗原靠近腫瘤細胞的膜。CD8α跨膜結構域用於將抗cd19 CAR分子固定在T細胞的膜上。CD28和4-1BB信號域為t細胞激活提供共刺激信號。CD3ζ轉導激活信號並激活T細胞，如果這些細胞上的抗CD19 CAR與CD19抗原結合。
抗cd19 3 - g CAR-T細胞的生成
將通過白細胞分離從符合條件的參與者中獲得pbmc，並將如下方式生成抗cd19 3 - g CAR-T細胞。簡單地說，來自白細胞分離產品的T細胞將被Dynabeads Human T- activator CD3/CD28磁珠(Invitrogen Life Technologies)分離和激活。活化2-3天後，活化的T細胞將被轉導到經RetroNectin (Takara)預處理的24孔板中，然後用含有IL-7和IL-15 (5 ng/mL)的X-VIVO 15培養基(Lonza)進一步擴增，以達到所需的抗cd19 3 - g CAR-T細胞劑量。
研究目標
本研究的主要目的是評估固定單劑量自體3 - g CAR-T細胞輸注的安全性。不良事件和實驗室值將使用國家研究所的不良事件通用術語標準V.3.0進行分級。報告所有不良事件，直至疾病客觀進展。第二個目標是在體內測量3d - g CAR-T細胞的抗腫瘤反應和持久性。
免疫監視
根據一般研究方案，將收集全血樣本，分別使用流式細胞儀、定量PCR和流式細胞儀珠陣列檢測重定向T細胞亞群(naïve、中央記憶、效應體記憶和效應體T細胞)、CAR轉基因持久性和血漿細胞因子(幹擾素(IFN)-γ、IL-6、IL-8、sIL-2R-α、sgp130、sIL-6R、MCP1、MIP1-α、MIP1-β和GM-CSF)。第28天，骨髓抽吸及活檢。血漿細胞因子水平將用於預測嚴重細胞因子釋放綜合征(CRS)的發展。
3 - g CAR - t細胞毒性的管理
與CAR-T輸注相關的最重要和危及生命的並發症是CRS，這是一種非抗原特異性毒性，由高水平的免疫激活引起，其特征為發熱、惡心、肌痛、毛細血管漏、缺氧和低血壓。症狀通常與體內CAR- t擴增和某些血清細胞因子升高相一致，並在CAR- t輸注後幾天發生，但根據CAR結構中的共刺激結構域，可早至24小時。除了確定準確的CRS預測因子外，管理CRS的能力對於保護CAR-T細胞治療後的患者安全至關重要。因此，Lee DW提出了以下基於修正後的CRS分級體係的CRS管理處理算法36並將在當前的研究中采用(圖3)．CAR-T細胞引起的神經毒性可能在某些情況下，將按以下方法處理。簡單地說，地塞米鬆(10mg IV每6小時)將用於3級神經毒性(持續24小時以上的頭痛除外)，任何持續時間的4級神經毒性和任何癲癇(圖4)．37此外，由於CAR-T細胞引起的持續性b細胞再生障礙者會增加感染風險，因此在本研究中，持續性b細胞再生障礙者將在血清IgG水平<400 mg/dL時給予IV IgG。
CRS處理算法。CRS，細胞因子釋放綜合征。
神經毒性治療算法。CRS，細胞因子釋放綜合征;Q6h靜脈注射，每6小時靜脈注射一次。
數據管理
我們的學習小組成員組成了一個試驗管理委員會。數據每周由AZ和D-HW收集、清理並發送給委員會，每月與首席研究員舉行會議，討論試驗進展。為了防止數據輸入錯誤，所有數據都被重複輸入到計算機中。數據的傳輸是加密的，以保護患者的機密性。
統計分析
變量將使用GraphPad Prism V.5.0進行分析，結果將顯示為平均值和標準差。所有實驗的均數之間差異的顯著性采用雙向方差分析，p值<0.05為有統計學意義。
道德問題
審判將根據《赫爾辛基宣言》(2008年)的原則進行。研究醫師將從所有參與者處獲取書麵知情同意書。患者可以在任何時候自由退出試驗，他們的信息將僅限於研究醫生。該試驗方案於2014年7月獲得了機構審查委員會的批準。
傳播
研究結果將通知參與者、醫療專業人員、公眾和其他相關團體，試驗結束後，研究結果將發表在同行評審的期刊上。
討論
中國每年約有9000例ALL新發病例(每10萬人中有0.69例)，超過80%的成人ALL在標準誘導方案下完全緩解。無論進一步的鞏固治療和維持化療，高達20%的患者將對初始治療難治，另外30%-60%的患者將複發。長期無白血病生存率<50%，大多數r/r ALL患者將死於其疾病。38因此，CAR-T細胞療法——用CAR改造T細胞，改變T細胞的特異性和識別腫瘤抗原的功能——正在研究用於r/r成人B-ALL的治療。顯然，CAR-T免疫治療成功的關鍵是靶點的選擇。一些靶點可以用於抗b - all CAR-T的發展，如CD19, CD22, CD20, CD24等。在這些靶點中，CD19是B- all CAR-T細胞最有希望的靶點，因為它在惡性B細胞中廣泛表達，包括大多數淋巴瘤和淋巴細胞性白血病，並且高度限製於正常成熟B細胞和B細胞前體，而不損害造血幹細胞。39，40
迄今為止，使用抗cd19 CAR-T治療B-ALL的I/II期試驗有12項(見表1)．11項試驗(約92%)選擇了攜帶CD28或4-1BB結構域的2 - g CAR- t細胞，這些2 - g CAR- t細胞在B-ALL患者中取得了有希望的結果。此外，包括CTL019(瑞士諾華)、JCAR015 (Juno therapeutics，美國)和KTE-C19 (Kite Pharma，美國)在內的三種產品被美國食品和藥物管理局(FDA)授予突破性療法稱號。然而，CD28或4-1BB共受體的不同信號傳導對CAR-T細胞的代謝特征有不同的影響，並平衡對長期持久性(長壽命記憶)或立即抗腫瘤效力(短期效應細胞)的反應。此外，一項臨床前研究表明，與攜帶CD28信號域的2 - g CAR-T細胞相比，結合CD28和4-1BB共受體的3 - g CAR-T細胞具有更好的體外激活和增殖能力，並且兩種細胞在體內清除CD19+ B細胞的效果相當。35另一項臨床前研究表明，3d - g CAR-T細胞在體內的持久性不如2d - g細胞。41但目前缺乏3d - g CAR-T細胞在患者中的臨床數據。因此，應該在B-ALL患者中研究這些細胞的安全性和有效性。
CRS是最常見的嚴重不良事件，發生在CAR-T治療後幾天，通常由體內CAR-T增殖和包括IL-6和IFN-γ在內的幾種血清細胞因子的顯著升高引起。不幸的是，在臨床試驗中觀察到的CRS並沒有在小鼠模型係統中準確重現，這些白血病異種移植模型可能不適合進一步研究CAR-T細胞的長期影響。首先，移植的人CAR-T細胞可能會受到免疫缺陷小鼠免疫係統殘留元素的挑戰。另一方麵，CAR-T的毒性很難評估，因為人CD19的表達譜可能與小鼠的不一樣。41因此，在臨床試驗中預測和管理嚴重CRS的能力對於保護患者的利益至關重要，因為早期幹預可能會限製CAR-T免疫治療的療效，而晚期幹預可能會增加治療患者的發病率和死亡率。為此，一種新的CRS嚴重程度分級係統和基於嚴重程度的CRS管理治療算法在2年前被提出(如圖2所示)圖3)．此外，最近發現了一些CRS的預測性生物標誌物，作者發現CAR-T輸注後第一個月24種細胞因子的峰值水平，包括IFN-γ、IL-6、sgp130和sIL-6R與嚴重CRS高度相關。42此外，我們的慢病毒技術供應商的臨床前結果表明，cd19靶向3 - g CAR-T細胞在消除異種移植白血病方麵是有效的。43因此，一項使用修訂的CRS分級係統和嚴重CRS預測生物標誌物進行CRS管理的I期臨床試驗首次在r/r ALL成年患者中進行，以評估由慢病毒修飾的cd19靶向3 - g CAR-T細胞的安全性和有效性。
致謝
作者感謝劉浩博士對手稿的英文編輯。我們非常感謝誌願者在這項研究中的慷慨參與和貢獻。
參考文獻
腳注
貢獻者X-YT, BZ和HC構想了這個想法。HC, BZ和D-HW設計了研究。所有作者都對稿件的撰寫做出了貢獻。所有作者都審查了該方案。X-YT, G-LH, YS, WC和AZ將進行分析。HC是主要研究者。
資金本工作由中國科學院臨床特征與應用研究基金資助(資助號:Z111107058811107)。
相互競爭的利益沒有宣布。
病人的同意獲得的。
倫理批準中國軍事醫學科學院附屬醫院機構審查委員會批準。
出處和同行評審不是委托;外部同行評審。
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