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目標我們的目標是報告四個小說α-gal基因(杯子)突變導致Fabry疾病(FD)和提供證據的致病性D313Y突變有關矛盾的數據已經在文獻中提出的。
設置和參與者25家庭成員的九個不相關的明確的FD患者診斷、10臨床疑似病例和18他們家庭的成員包含在這個多中心隊列研究。
主要和次要結果的措施基因分型和lyso-Gb測量3在所有的個人表現。α-Gal活動以所有人以及血漿和尿液Gb3在選定的情況下濃度。光學和電子顯微鏡進行腎活檢的選擇病人。上述所有進行評估與病人的臨床資料。
結果14個新例FD承認,四是攜帶已經描述杯子突變。四個小說杯子突變,即c。835 c > T, c。280 t > A, c。92年4一個>C and c.511G>A, resulting in a classic FD phenotype were identified. Moreover, FD was definitely diagnosed in five patients carrying the D313Y mutation. Eight D313Y carriers were presenting signs of FD despite not fulfilling the criteria of the disease, two had no FD signs and two others were apparently healthy.
結論四個小說杯子致病性突變報告和證據的致病性D313Y突變。似乎D313Y later-onset溫和的表型相關的基因突變是與正常lysoGb比典型的表型3濃度。我們的研究強調了家庭成員基因分型和新生兒篩查的意義,以避免誤診和至關重要的疾病的診斷和治療的延誤。
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本研究的優點和局限性
這是最大的係列臨床評估男性和女性文學的載體α-gal基因(杯子)D313Y突變可能支持其致病性,偶爾被腎活檢證實。
小說杯子突變導致經典Fabry疾病表型。
主要的限製是老年參與者缺乏詳細的臨床資料。
影響器官的活檢,明確診斷的金標準,在所有情況下都不可用。
介紹
FD或Anderson-Fabry疾病的x染色體遺傳性代謝障礙,α-gal基因突變的結果(杯子基因),導致酶活性降低和隨後的積累Gb3(或GL-3)在血漿、尿液和全身細胞溶酶體。這些口供引起多係統病理學和危及生命的表現,包括腎功能衰竭、心髒和腦血管疾病。1 2
目前已知的900多杯子突變已確定3 4導致各種各樣的臨床表現。他們中的大多數是獨一無二的家庭(私人),因此genotype-phenotype相關性是有限的。5診斷FD挑戰由於模仿的障礙疾病和各種各樣的典型臨床表現。因此,underdiagnosis和FD的誤診導致後期診斷、適當治療的延誤和隨後的消極的預後。6人類遺傳分析必須排除或執行驗證杯子突變。7一旦診斷,生物化學和分子遺傳分析,以及遺傳谘詢,應該提供給所有家庭成員。8每個病人的詳細的譜係分析呈現與FD是至關重要的,9因為它可以通知淵源者的診斷和識別高危親屬。10
我們的目標是報告四本小說杯子突變導致FD和提供證據的致病性D313Y突變有關矛盾的數據已經在文獻中提出的。
方法
研究設計和設置
這是一個多中心人口篩查研究從希臘的個人展示FD的表型性狀暗示或屬於家庭的一個明確的FD患者的診斷和履行任何一個以下入選標準:
FD的明確診斷。
對FD Nephrological、心髒或神經係統症狀。
診斷明確的FD患者的親屬。
一群19無關家庭的62名被試參與了這項研究。25是9定FD患者診斷和18的親屬的親屬10個人招募FD特質在他的航空公司杯子突變檢測。D313Y突變的存在145年希臘人口由pcr檢查顯然健康受試者(70名男性,75名女性)。書麵知情同意了每一個主題或者一篇相對合法適當的。機構審查委員會批準的這項研究是大學的塞薩利,拉裏薩。
臨床評估
病人的醫療記錄進行評估和詳細病史的家庭成員,尤其是關於心髒或腎髒疾病,腦血管事件,死亡在年輕的時候和各自的死因。所有參與者接受了體檢特別關注心髒,腎髒和神經係統症狀和體征。詳細構建了每個家庭血統和新生兒篩查。
實驗室評價
在星展銀行,我們測量α-Gal活動在所有男性受試者使用串聯質譜,11lyso-Gb3在所有科目使用高效液相色譜法和串聯譜,12以及血漿和尿液Gb3濃度在選定的情況下使用串聯質譜分析。13
光學和電子顯微鏡研究是偶爾做腎活檢。
基因分型
基因組DNA提取使用iPrep純鏈接從外周血DNA血液工具包(美國Thermofisher英傑公司)根據製造商的指示。所有編碼的區域和exon-intron接頭連接杯子基因分析有針對性定製下一代測序(上天)平台(Ampliseq自定義麵板中,熱科學)。分析的主要數據進行離子記者軟件v.5.2(熱科學)。常見的多態性(UCSC的常見snp)被排除在外,致病性變異使用PhyloP預測的生物信息學分析,篩選,格蘭瑟姆和PolyPhen工具,相比全球(1000基因組全球微小等位基因頻率,ExAC)和歐洲的頻率(5000歐洲小等位基因頻率外)。變異的描述是基於推薦的美國大學醫學遺傳學與基因組學(ACMG)和分子病理學協會。14
小說變異被PCR結合Sanger測序驗證。放大的杯子外顯子(包括exon-intron邊界)在五反應進行相應的外顯子1,2,3,4,5 - 7,使用引物中補充材料。100 - 200 ng基因組DNA擴增的PCR在30µL反應混合物使用200µM每個deoxynucleoside三磷酸,30 pmol每個引物,1.5毫米MgCl2和1.0 U Taq(美國Thermofisher英傑公司)10 x緩衝區由製造商提供的。反應條件如下:外顯子1 - 3:2分鍾94ºC,緊隨其後的是30周期30年代在94ºC, 30年代在58ºC, 30年代在72ºC,和最後一個擴展在72ºC 5分鍾。外顯子4和5 - 7:2分鍾94ºC,緊隨其後的是32周期30年代在94ºC, 30年代在54ºC, 30年代為外顯子4或75年代外顯子5 - 7在72ºC,和最後一個擴展在72ºC 5分鍾。所有PCR反應進行了在Veriti 96 -熱循環(美國Thermofisher應用生物係統公司)。PCR引擎裝置和使用PureLink的新興PCR產物純化PCR淨化裝備係統(美國ThermoFisher科學)。使用引物測序進行描述的補充表使用3730 DNA分析儀(美國Thermofisher應用生物係統公司)和BigDye終結者DNA測序工具包(美國Thermofisher應用生物係統公司),根據製造商的指示。
結果
九(所有明確的FD)的62組受試者攜帶五前所述杯子突變:c。334 c > T (p。一個rg112Cys, R112C), c.644A>G (p.Asn215Ser, N215S), c.1153A>C (p.Thr385Pro, T385P), c.453C>G (p.Tyr151Ter, Y151X) and c.782G>T (p.Gly261Val, G261V).
c。93年7G>T (p.Asp313Tyr, D313Y, NM_000169.2) mutation was revealed in 17 individuals (54±14, range 27–78 years), 7 men (61±11, range 45–78 years) and 10 women (49±15, range 27–70 years) but in none of the healthy subjects. Patients’ clinical and laboratory findings are presented in表1。所有男性患者(61±11日,45 - 78歲)提出一個α-gal活動下降56.2 - -87.5%的範圍與正常相比,除了一位病人α-gal活動是在正常範圍內。LysoGb3發現濃度正常(範圍0.8 - -1.7 ng / mL)在所有的病人,而血漿和尿液Gb3濃度變化,如圖所示表1。
FD的診斷根據最近出版的標準絕對是造成的疾病15五這種突變攜帶者(54±9日,45 - 65歲)。第一個(病人沒有。1,表1),一名52歲的男子,最初診斷48歲的患有慢性腎髒疾病(CKD)第三階段,並不是心髒或其他FD的跡象。腎活檢進行因為non-nephrotic蛋白尿,鏡下血尿和血清肌酐,顯示焦點和節段性腎小球硬化症(FSGS)——崩潰的變體。當時,酶活性和血漿lyso-Gb3濃度是正常的。最初的三年之後表示病人終末期腎病和極端的肢端感覺異常。評估使用更高的放大倍數的腎活檢發現焦細胞質microvacuolisation擴大足細胞(圖1),α-gal活動減少了50%,增加等離子體(7.52 nmol /毫升,參考:0.8 - -4.52)和尿液Gb3濃度(147.49 nmol / g,參考:< 29.00)。病人開始透析和酶替代療法(ERT)與臨床快速改善。
光學顯微鏡的結果從一個男性患者腎活檢Fabry疾病(FD)攜帶的D313Y突變杯子。(A)和節段性腎小球硬化症- PAS×400。(B)節段性硬化特性的“崩潰”的變體(箭頭)-瓊斯的銀×400。(C)蒼白出現小麵積的腎小球硬化堅持腎小球囊(箭頭)——不是×400。(D)細胞質microvacuolisation底部突起(箭頭),暗示了FD - PAS×400。
第二個D313Y突變的載體是一個46歲的女人(病人沒有。4,表1)曾有短暫性缺血性發作,兩艘來曆不明的缺血性中風,曾經被認為是。在評價,去年中風後1年,病人出現微蛋白尿、水腫和肢端感覺異常。微蛋白尿重複3個月後,肢端感覺異常惡化。Gb3濃度是病態的尿液(54.08 nmol / g)但在等離子體正常。LysoGb3濃度是正常的,保持穩定的一年。
上麵的病人(病人沒有的母親。5,表1),65歲,50歲時被診斷與多發性硬化和接收相對藥物,沒有臨床受益。她也接受治療四肢疼痛,歸因於風濕性關節炎。近年來患者流動障礙(報告為痙攣性四肢癱瘓的神經檢查後),抑鬱和癡呆。評估病人的病理透露等離子Gb3濃度(4.7 nmol /毫升),白質病變(WML)大腦核磁共振和正常的腎功能。LysoGb3濃度是正常的,所以在6個月的隨訪。
的另一個載體D313Y突變是一個45歲的男人(病人沒有。7,表1由於CKD)透析25歲。不需要進行腎活檢。他在童年和青春期的血尿,報告認為當時膀胱輸尿管的反胃。酶活性略下降(2.4μmol / L /小時,參考:≥2.6)和血漿lyso-Gb3濃度是正常的。腦MRI顯示WML和vertebrobasilar血管的變化。此外,病人增加了心髒室間隔回聲在更高頻率的超聲心動圖和感音神經性聽力損失。病人開始ERT。
最後肯定D313Y突變診斷為FD患者是一個60歲的女人(病人沒有。17日,表1)出現角膜verticillata corneopathy, WML和缺血性中風梗塞腦MRI盡管沒有被報道,肢端感覺異常和胃腸道(GI)症狀(疼痛、腹瀉)因為青春期,hypohidrosis,聽力損失和左心室肥厚(LVH)。
在剩下的12 D313Y突變攜帶者沒有FD患者有兩個跡象和8個病人(55±17日範圍27 - 78年)提出與其他FD症狀,主要是神經係統;然而,他們不能FD的文檔的一個明確的診斷。特別是病人沒有。6,表1(62歲的婦女)自青春期以來肢端感覺異常和胃腸道症狀和lysoGb呈現31.7 ng / mL(參考:≥1.8)。因此,病人沒有。16日,表1(64歲的老人)與慢性腎病,糖尿病和聽力損失,而腦部MRI顯示多個缺血性中風梗塞盡管沒有被報道。剩下的兩個D313Y突變攜帶者顯然是健康的。
小說杯子(4)突變(圖2)被發現在13個成員(39±18,範圍1 - 69年)四個不相關的家庭(表2),所有實現的診斷標準確診FD [15]。c。83年5C>T mutation (p.Gln279Ter, Q279X) in exon 6 of the杯子基因被發現在四個成員(30±24日範圍1-60年)的希臘家庭。淵源者,一個31歲的男人,給了23歲的蛋白尿(3.5 g / 24小時)、鏡下血尿、腎功能惡化,右束支阻滯,輕度高血壓和血管擴張性疣的手臂和腰部區域。他說四肢疼痛,特別是在感染,和無法汗水。α-gal活動接近於零。心髒磁共振成像顯示中度LVH。腎活檢顯示細胞質液泡化,延長了溶酶體累積在所有類型的腎細胞,尤其是在足細胞(圖3)。病人目前正在ERT有益結果與腎功能方麵,蛋白尿和痛苦。三個家庭的其他成員都顯示相同的突變和臨床FD的跡象。淵源者的母親(60歲)報道TIA 32歲。腎髒檢查顯示蛋白尿(> 500毫克/ 24小時)、鏡下血尿和正常腎髒功能。心髒磁共振成像顯示嚴重LVH(心髒室間隔19毫米)和在手臂皮膚檢查顯示血管擴張性疣。她的母親(淵源者的祖母)去世,享年62歲,由於心髒驟停。她嚴重的LVH和肢端感覺異常,當時歸因於雷諾氏現象。先證者的妹妹(27歲)lyso-Gb升高3濃度(2.7 ng / mL)和她的新生兒篩查的女兒也揭示了突變。
桑格確認新的突變。
電子顯微鏡發現男性患者的腎活檢Fabry疾病(FD)攜帶Q279X突變。Multi-lamellated髓數據(“斑馬”的身體),一個典型的FD的發現,與黑色的箭頭標記(a)亞甲藍semithin部分,(B)管狀細胞和纖維母細胞和足細胞(C, D)。
4例(46±11日範圍30-56年)屬於另一個希臘家庭攜帶c。280 t > (p。Cys94Ser, C94S) mutation. The proband, a 48-year-old woman, was diagnosed with FD a year before after presenting with increased lyso-Gb3濃度(5.4 ng / mL),增加血漿Gb3濃度(6.14 nmol /毫升),沒有其他來源的微蛋白尿,角膜verticillata corneopathy,雙手和dyshidrosis肢端感覺異常。臨床和實驗室數據影響的其他家族成員介紹表2。
c。92年4一個>C mutation (K308N – p.Lys308Asn) in exon 6 of the杯子希臘的基因被發現在三個家庭成員(44±26日範圍17 - 69年)。淵源者,一名46歲男子,給了34歲的蛋白尿(0.5 - -0.6 g / 24小時)、鏡下血尿了10年,輕微的高血壓。腎髒功能是正常的。腎活檢顯示輕微的係膜增生性損害和足細胞的細胞質microvacuolisation。α-gal活動幾乎為零。10年隨訪後他LVH和蛋白尿(1.8 g / 24小時)。病人目前正在ERT。他的母親和女兒攜帶相同的突變。淵源者的祖母去世了,享年68歲,患有嚴重LVH及終末期心力衰竭。
最後,c。511G>A mutation (G171S – p.Gly171Ser) in exon 3 of the杯子基因被發現在兩個成員(37±4範圍34-39年)阿爾巴尼亞的家庭生活在希臘。淵源者,一名39歲男子,32歲被診斷出嚴重腎功能惡化和蛋白尿。沒有進行活檢當時由於腎髒的體積小。近一年之後,他麵對嚴重的急性腎功能衰竭的臨床和實驗室研究結果,需要透析。正常的腎功能沒有恢複。FD絕對是37歲的診斷,隨著α-gal活動非常低和lyso-Gb3濃度為11.9 ng / mL。肺動脈直徑增加,患者LVH升主動脈和主動脈瓣狹窄的擴張,由於他接受瓣膜置換手術。眼科評估表明脂質沉積和模糊強度的角膜。病人目前正在ERT。他34歲的弟弟被確認與相同的突變和極低的α-gal活動,lyso-Gb3濃度12日9 ng / mL和蛋白尿沒有其他病因學。
討論
D313Y突變
矛盾結果的致病性突變已報告在文獻中自1993年首次描述。16患者的突變被發現在許多係列呈現FD的跡象。17-24然而,Niemann等25形容這種變體非致病性的,雖然他的兩個患者呈現與降低α-gal活動。同樣,奧得河等26支持D313Y基因型不導致嚴重的器官如基因型表現為古典FD和Froissart因果等27描述pseudodeficient等位基因的突變,這意味著它是一個編碼的序列變異被運送至溶酶體酶,在大約75%的正常酶活性。D313Y突變也被稱為多態,19盡管事實上,根據ExAC和1000基因組數據庫,其頻率在世界和歐洲人口低於1%。最後,它必須提到生物信息學分析表明,這種突變可能是預測破壞(PolyPhen-2)或損害(篩選)。
在我們的研究中,5 17 D313Y突變攜帶者(54±9,45 - 65歲)被證明有明確的根據最近出版的標準FD的疾病。15疾病病人的陳述表明,突變的結果在一個較溫和的表型,與後來出現症狀。這種表型,也包括溫和的mono -或oligosymptomatic情況下,19特點是作為非典型或2型。28晚期發病的臨床症狀和溫和比典型的FD表型可以部分解釋在這些患者高α-gal剩餘活動,因為有證據表明,變異的α-gal達到溶酶體的細胞。29日實際上,除了我們研究男性D313Y載體之一,α-gal活動減少。D313Y酶活性下降的另一個原因在等離子體可能是一個功能不耐受血漿中性pH值條件。這種影響是不可逆轉的,一旦接觸pH值中性或基本環境,D313Y酶仍不活躍,即使轉移到最佳pH值。21日29日
有趣的是,絕大多數的我們D313Y患者出現神經係統症狀和體征。此外,其中一個被誤診為女士而突變的兩艘航母,在他沒有建立一個明確的FD診斷,被診斷為多發性硬化症和相應治療。同樣的詳細研究腎活檢在我們的情況下構成的早期檢測的意義在例FSGS Fabry-specific發現。
小說突變
上述小說的致病性突變被undoubtfedly證明為所有航空公司明確的FD。這些運營商,c。835 c > T (p。Gln279Ter, Q279X) is a nonsense mutation causing an interruption of the reading frame by a premature stop codon, which results in a truncated protein. A truncated protein and the subsequent loss of its functionality is strong evidence that the mutation is probably pathogenic for FD [14]. No amino acid change at this position has ever been described in the NCBI and Fabry Database (http://fabry-database.org/)。30.
至於c。280T>A (C94S), c.924A>C (K308N), c.511G>A (G171S) mutations are concerned, bioinformatics analysis supports their disease-causing effect as they are predicted as probably damaging (PolyPhen-2) and/or damaging (SIFT). Further evidence of their pathogenicity could be the fact that the same aminoacid changes at the corresponding positions but in different nucleotides have already been described as disease causing.33節
結論
我們報告四個小說杯子突變導致FD。此外,我們提供了強有力的證據表明D313Y突變可能致病。這種突變似乎比典型later-onset溫和的表型相關表型正常lysoGb3。
另外我們的研究強調家庭成員基因分型的意義,新生兒篩查和遺傳谘詢在避免誤診和至關重要的疾病的診斷和治療的延誤。最後,我們確認這一事實雜合的女性可能會輕微到嚴重FD, genotype-phenotype相關不存在即使在同一家庭的成員。
確認
我們感謝Andrikos的幫助和建議,年代Kouzouka Triantafillou, D Kaltsidou Kaliantzoglou, Lysitska,帕帕多普洛斯K, K Zoganas, G Tsivgoulis Z Tegou Fountoglou, T Karapanagiotidis Patsialas。
引用
腳注
貢獻者樂:收集、分析和解釋數據的譜係分析,文獻綜述,起草和修改的手稿。KS:腎活檢和電子顯微鏡分析。PP:腎活檢和光學顯微鏡分析。女士,MZ和GL:基因分型和生物信息學分析。KS、PP、EM、PK、CK、AO, JK:治療病人的醫生。AEG:設計研究和協調,修訂手稿。所有作者批準了最終版本的手稿。
資金支持的研究部分研究委員會的資助大學的塞薩利。
相互競爭的利益KK收到郡旅行援助和Genzyme議長夏爾的謝禮。KS接到郡旅行援助和議長的謝禮。頁和AO收到Genzyme旅行援助和夏爾。CK接到郡旅行援助。AEG接到夏爾研究資助。作者MZ, GL,女士,EM, PK, JK,報告沒有利益衝突。
倫理批準這份報告是大學的機構審查委員會批準的塞薩利,拉裏薩。書麵通知同意從患者參與了。
出處和同行評議不是委托;外部同行評議。
數據共享聲明所有的數據都支持我們的研究結果是包括在手稿中。