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摘要
客觀的馬來西亞缺乏流行病學數據和分子診斷服務，阻礙了為1型肌強直性營養不良症(DM1)患者建立全麵的管理計劃，導致診斷、治療和對患者和家庭的支持延遲。本研究的目的是估計DM1在馬來西亞3個主要民族中的患病率，並評估單管三聯PCR (TP-PCR)方法診斷馬來西亞DM1的可行性。
設計，設置和參與者我們從吉隆坡的一家三級醫院招募了377名未被糖尿病影響的個體和11名DM1疑似患者，用PCR方法測定了CTG重複序列的大小。選取樣本進行TP-PCR，然後對PCR擴增片段進行Southern blot雜交，以確認和估計CTG擴增的大小。
結果測量已知未受DM影響的人數(CTG)> 18是根據民族和整個人口來確定的。的χ2(CTG)的分布> 18和其他12個族群。此外，通過將TP-PCR檢測11例DM1患者CTG擴增的結果與Southern blot雜交的結果進行比較，確定TP-PCR檢測CTG擴增的準確性。
結果在被研究的754條染色體中，(CTG)> 18馬來、中國和印度亞群的頻率分別為3.60%、1.57%和4.00%，與泰國、台灣和科威特人群的數據相似。我們還使用TP-PCR方法成功檢測了9例患者的CTG擴增，然後通過Southern blot雜交估計CTG擴增大小。
結論結果顯示馬來西亞DM1患病率較低，可能存在診斷不足的情況，並證明了在發展中國家使用基於臨床和tp - pcr的方法進行快速和經濟有效的DM1診斷的可行性。
- CTG重複
- 遺傳谘詢
- 肌強直性營養不良1型
- 分子診斷
- TP-PCR
- 患病率
這是一篇開放獲取文章，根據創作共用屬性非商業(CC BY-NC 4.0)許可證發布，該許可證允許其他人以非商業方式分發、混音、改編、在此作品的基礎上進行構建，並以不同的條款許可其衍生作品，前提是原始作品被正確引用且使用是非商業性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/
數據來自Altmetric.com
本研究的優勢和局限性
這是第一個針對馬來西亞三個主要民族中未受DM影響的個體的肌強直性營養不良1型(DM1)流行病學研究。
迄今為止，馬來西亞的任何醫院都沒有對DM1進行分子診斷檢測。本研究描述了一種經濟高效的三聯引物pcr快速篩查和診斷DM1的方法的可行性。
基因分型數據並沒有給出精確到一個三核苷酸重複的等位基因大小，而是等位基因大小的近似值。
分析的DM1樣本數量很少，因為DM1在馬來西亞是一種罕見疾病。
簡介
肌強直性肌營養不良症(DM)是世界上最常見的成人肌肉營養不良症，估計患病率為1 / 8000。1他們被分為兩個主要的亞組，DM1型(DM1)和DM2型(DM2)。這些是由核苷酸重複擴增引起的，這是一種常染色體顯性遺傳特征，並表現為臨床異質性疾病。DM1是由於CTG核苷酸重複超過正常長度5-49，在3′未翻譯區營養不良myotonica蛋白激酶(DMPK)基因，位於染色體19q13.3上。2，3.這是一種進行性疾病，分為幾個亞型。先天形式的DM1是母體傳播更頻繁，盡管疾病發生在男性和女性相同。1，4一般的共識是，個體的CTG重複次數越大，疾病越嚴重，發病年齡越早。然而，僅僅基於CTG重複序列的大小，很難將單個DM1病例劃分為不同的類別，因為基因型-表型相關性經常重疊，而且沒有明確的定義。此外，重複的大小在組織之間和同一組織中隨著時間的推移都有變化。5，6這使得疾病的預後變得困難。在疾病的遺傳中也可以觀察到預期的遺傳現象，導致疾病的形式更嚴重，並且在後代中發病年齡更早。7，8
DM1的患病率在不同人群中差異很大，主要見於歐洲人和日本人。9，10一項研究還估計芬蘭人口的發病率很高。11在加拿大魁北克省，由於奠基人效應，DM1患病率特別高，為1 / 500。12相比之下，這在撒哈拉以南的少數民族人口中是一種罕見的疾病，13除了尼日利亞報道的一例病例外，幾乎聞所未聞。14最近還觀察到兩例非裔美國人的病例，很可能代表了最近的人口混合。15鑒於這種差異，研究人員開展了一項研究，以確定CTG重複序列在非洲不受DM1影響的個體中的分布。結果表明，非洲人群與歐洲、日本人群中CTG正常等位基因大於18的分布存在極顯著差異。13這重申了先前的理論，即19 - 30歲之間的CTG等位基因是後代DM1突變的來源。16這些發現形成了估計人群中DM1發病率的基礎。13，17-27
在分子診斷試驗建立之前，臨床上診斷DM1主要是通過觀察臨床症狀和進行肌電圖(EMG)測試，並通過肌肉活檢確認。28目前，有幾種分子技術可用於DM1診斷，對侵入性和疼痛的肌電圖測試和肌肉活檢幾乎沒有用處。29然而，能夠檢測所有膨脹大小範圍的單一測試還有待建立。實驗室通常根據種群中的突變動態和可用的設備采用多種方法的組合。常規PCR可以檢測CTG重複序列的正常範圍以及預突變等位基因。優化的PCR條件可以檢測到(CTG)以下的等位基因85，而其他地區則依賴於Southern blot進行檢測。開發了三聯體引物PCR (TP-PCR)方法來檢測大擴增等位基因的存在，從而減少了反射性Southern印跡試驗的數量。30.
作為一個東南亞國家，馬來西亞的人口主要由馬來人、華人和印度人組成。還有一大群屬於不同部落的土著人民。雖然DM1在這個國家還沒有被頻繁診斷出來，但由於對這種疾病的不同表現缺乏認識，有可能誤診或漏診。沒有對主要民族群體中該病的流行率和發病率進行過研究，據我們所知，在我國任何地方都沒有這種疾病的分子水平診斷測試。鑒於患者的多係統和可變表型表現，因此，重要的是提供一個簡單的標準確認性診斷試驗，特別是在試圖排除不同的診斷時。在這裏，我們報道了使用PCR和Southern blot雜交方法對馬來、中國和印度亞人群中未知的DM影響個體進行分子分析，在這些亞人群中，我們研究了CTG等位基因的長度，以預測DM1在這些亞人群中的患病率。我們還描述了使用單管TP-PCR方法在馬來西亞患者中篩查和確認DM1，目的是減少需要進行的Southern blot檢測的數量。
材料與方法
道德聲明
倫理委員會要求在研究中招募的所有人類參與者都被簡要介紹了研究的性質，並提供了一份描述研究的信息表。參加者亦得到保證，他們的私隱將會受到保護，所提供的個人資料將會保密。參與這項研究是在自願的基礎上進行的，對醫院接受的病人的護理質量沒有影響。
樣品收集
來自377名隨機選擇的馬來人、華人和印度裔不知道患有糖尿病的匿名獻血者的血液樣本經口頭同意後從馬來亞大學醫學中心(UMMC)血庫獲得。此外，本研究還招募了11名表現出dm樣症狀的患者。從這些患者獲得書麵同意書、臨床和家族史。參與者的種族被確定為馬來人、華人或印度人，這是基於他們自己的承認。
分子分析
根據製造商的協議(QIAGEN, Hilden, Germany)，使用QIAamp DNA血液迷你試劑盒從血液樣本中提取基因組DNA。
常規PCR
樣品的分析是根據Surh描述的技術進行的等．31使用Perkin Elmer GeneAmp PCR係統在30µL的終體積中進行PCR。使用正向103,5 ' -CCA GTT CAC AAA CCG CTC CGA GCG TG-3 '和反向96,5 ' -GGT GCG TGG AGG ATG GAA CAC GGA C-3 '引物。PCR條件設置為:96℃初始變性5 min，隨後分別在96℃、62℃和72℃變性、退火和伸展25個循環，每步1 min。在72°C下進行終伸7 min。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，100 V, 45 min。從凝膠中分離出產物，使用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN, Hilden, Germany)進行純化，並將其送到服務實驗室進行測序，以確定CTG重複的確切數量。
Triplet-primed PCR
樣品的分析是根據辛格描述的技術進行的等．32對13個樣本進行了TP-PCR分析，其中11個有DM1症狀，2個不知道受DM影響的對照組。招募的參與者都是年齡在30至60歲之間的成年人，以及1個5歲的兒童。從血液樣本中提取100 ng基因組DNA，反應量為25 μL。引物FAM- p1 -forward 5 ' fa - ggg GCT CGA AGG GTC CTT GT-3 '和P2-reverse 5 ' -GTG CGT GGA GGA TG AAC ACG-3 '位於CTG重複區兩側，正向引物用FAM(熒光素)熒光標記。第三個引物P3 5 ' - agc GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA - 3 '被設計與第四個引物P4-(CAG)尾部補體結合。6-反向5 ' -AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG cag3 '。引物組合按照FAM-P1-forward: P4-(CAG)的比例製備。6-reverse:P3:P2=1.5:1:1:1.5:1.5，最終工作濃度為0.6:0.4:0.6:0.6µM。TP-PCR條件設置如下:95°C初始變性5 min，隨後變性(97°C) 35 s，退火(65°C) 35 s，延伸(68°C) 4 min，各10個循環。隨後進行變性、退火和延伸20個循環，每個循環延長20 s，以提高PCR產物的得率。產品在ABI PRISM 3130×1遺傳分析儀(Life Tech)上分離，片段大小使用genemark V.2.6 (Softgenetics, State College, Pennsylvania, USA)確定。
PCR擴增片段的Southern blot雜交
對擴增後的PCR片段進行Southern blot雜交，結果在電泳圖中僅顯示單峰，表明CTG擴增或未擴增等位基因純合子。常規PCR產物一夜之間從瓊脂糖凝膠轉移到帶正電荷的尼龍膜上，通過毛細管轉移和紫外線交聯法將DNA固定在膜上。將膜在混合緩衝液中混合過夜，並加入20µL堿性磷酸酶共軛(CTG)。10寡核苷酸在50°C。然後膜被移除，多餘的液體排出，在使用預熱洗滌緩衝液清洗之前。在膜的混合和洗滌之後，應用CDP-Star檢測試劑，隨後通過將印跡暴露在放射自顯影膜上進行信號顯影。通過比較DNA分子量標記獲得的條帶或塗片的大小來鑒定dm1陽性樣本。膨脹的大小被確定為自顯影上的最高帶強點。為了估計膨脹的大小，首先將100 bp或1 Kb大小的標記片段的長度轉換為對數值。然後，這些值在y軸上與它們在x軸上的遷移距離相對應。利用線性回歸，通過這些點畫出一條最佳擬合的直線，並推導出描述這條直線的方程。未知片段的遷移距離從擴展等位基因的最強烈區域導出，被放入回歸線的方程中，以確定片段大小的對數值。取這個值的反對數得到未知片段的堿基對大小。 This value is an estimate of the average repeat number and is dependent on age at sampling.
統計分析
從不知道受糖尿病影響的個體的754條染色體中計算每個等位基因的頻率。采用χ法進行統計學分析2用Yates校正檢驗比較正態大重複的分布(CTG)> 18美國還有其他12個族群。
結果
一般人群DMPK CTG重複長度變異分析
(CTG)的分布> 18馬來、中國和印度亞群中的等位基因都指向DM1的低患病率。圖1顯示了三個亞種群中所有等位基因的分解。(個人基因分型數據在網上提供補充文件1-3。)雙峰等位基因分布被注意到，這與在其他低DM1頻率的人群中觀察到的模式一致。第一個高峰來自(CTG)5等位基因，占所有等位基因的33.7%，而第二個高峰由3個等位基因組成，11-13個占大多數，占總等位基因的51.1%。(CTG)的頻率> 18馬來亞群等位基因數為9/250=3.60% (95% CI 0.0166% ~ 0.0672%)，華人亞群等位基因數為4/254=1.57% (95% CI 0.0043% ~ 0.0398%)，印度人亞群等位基因數為10/250=4.00% (95% CI 0.0193% ~ 0.0723%)。三個亞群體的雜合度分別為79.9%、77.0%和76.2%，平均為77.7%。這一結果與其他人群報告的結果一致，在歐洲的範圍為73.0%17而伊朗人的比例為92%。26
馬來人、華人和印度亞群中未被糖尿病影響的個體的CTG重複頻率。大正常等位基因(CTG)>18在馬來人的頻率為9/250或3.60%，在華人的頻率為4/254或1.57%，在印度人的頻率為10/250或4.00%。在馬來西亞人群中觀察到雙峰等位基因分布，與其他低DM1頻率人群中觀察到的模式一致。最常見的等位基因是(CTG)5在所有三個亞群中，而(CTG)10 - 13是最常見的等位基因組。每個個體的基因分型數據在網上提供補充文件1-3．DM1，肌強直性營養不良1型。
表1而且2顯示比較和χ2(CTG)頻率分析> 18在本研究的三個亞群體中，不知道受DM1影響的個體中，以及在世界範圍內的12個人群中，等位基因分別存在。(玻纖)> 18與歐洲、德國和智利人群的頻率相比，馬來人、中國人和印度人的頻率有顯著差異。所有三個馬來西亞亞群的頻率都與泰國相似，22台灣23和科威特24人群。同樣有趣的是，漢人與馬來西亞華人表現出相似之處，而大多數馬來西亞華人的祖先都是馬來西亞華人。這使得我們可以推測，馬來西亞華人中的DM1頻率較低，與漢人中觀察到的相似，24台灣23和南非黑人。13
診斷檢測DM1
采用TP-PCR方法分析了11例有dm1樣症狀的個體和2例不知道受DM影響的對照組的CTG擴增，然後用PCR擴增片段的Southern blot雜交進行確認。TP-PCR檢測結果顯示，其中9個樣本呈單峰，其餘4個樣本呈雙峰。單峰的樣品也表現出明顯的階梯狀，表明存在CTG膨脹(圖2)．PCR擴增片段的Southern blot雜交證實了9個樣本中DM1的診斷，擴增等位基因的大小為97-690個CTG重複序列，如圖所示圖3．表3顯示每個患者所表現出的疾病特征的摘要。圖4所示為我們所研究的家族和個體的譜係圖和CTG重複大小。值得注意的是，除了那些被診斷的人(深色方塊/圓圈)，其他家庭成員都沒有接受DM1檢查或測試。因此，有可能有些家庭成員表現出非常輕微的症狀，而他們並沒有在我們的診所出現，從而導致疾病在家庭中的明顯低傳播。
TP-PCR電泳結果。x軸表示堿基對大小，y軸表示等位基因峰值高度。(A)電泳圖顯示患者DM1樣本，單峰對應於(CTG)11還有一個階梯狀的圖案表明等位基因擴展了。(B) 2個大小為5和12的正常雜合等位基因，未觀察到階梯型。DM1，肌強直性營養不良1型;TP-PCR，三聯引物PCR。
放射自顯像片上可見PCR擴增片段DM1 Southern blot雜交患者擴增CTG重複序列。擴增的等位基因在97到690個CTG重複序列之間被檢測到。這裏顯示了一個波段樣本，範圍從270個重複(1045 bp)到690個重複(2305 bp)。4種大小的正常等位基因分別為5 (332 bp)、11 (350 bp)、12(353 bp)和13 (356 bp)。由於體細胞異質性，擴增的等位基因通常呈塗片狀。一個1kb的DNA階梯以及來自不知道受糖尿病影響的個體的樣本與患者樣本一起作為對照．糖尿病，肌強直性營養不良;DM1, DM類型1。
研究了DM1患者的譜係圖，包括他們CTG等位基因的大小。分析了三個家庭成員和兩個個體的CTG重複大小。每個病人等位基因對的大小在譜係圖中說明。在三個家係中均有明顯的預期現象，即隨著連續世代CTG擴張的增加，發病年齡逐漸減小。DM1，肌強直性營養不良1型;Pt,耐心。
討論
為了更好地了解DM1的負擔，我們使用CTG等位基因大於18在馬來西亞人群中的分布來估計DM1的患病率。(CTG)結果> 18馬來西亞人群為3.05%(23/754)。通過與其他人群的研究結果進行比較，我們預測DM1在馬來西亞是一種罕見疾病。需要更大的研究來驗證這些發現，因為這項研究的參與者是從馬來西亞首都的一家大醫院招募的，因此可能不能代表整個國家。由於公眾和醫療保健專業人員缺乏意識，當地社區的DM1很可能被診斷不足。還有其他影響因素，如社會汙名化，以及去提供專業谘詢和檢測的大醫院的機會減少。
以前進行的人口研究已經證明了(CTG)的相關性。> 18等位基因頻率與DM1患病率。在歐洲人群中，DM1的頻率估計為1 / 8000，對應於(CTG)。> 18∼10%。在光譜的另一端，DM1隻在一個南部非洲黑人家庭中報道，在那裏(CTG)的患病率> 18據報道是0.7%。在缺乏DM1真實病例的流行病學數據的情況下，巴西、墨西哥、泰國、台灣和中國漢族等其他人群報告的DM1患病率高於或低於已知患病率的人群。
本研究中確定的9例患者是在2011年和2012年確診的。這2年間，在UMMC就診的患者人數分別為957 418人和964 497人，共計1 921 915人。以這些數字為指導，我們估計馬來西亞DM1的患病率小於20萬分之一。這一估計值與泰國報告的DM1患病率的低估計值相似，22台灣23和科威特25在人群中，作者報告了觀察到的等位基因>18的頻率，並將它們與各自國家DM1的患病率相關聯。這也與我們χ的結果是一致的2分析。
有趣的是，(CTG)的頻率> 18在中國亞人群中是最低的，盡管他們占了我們醫院DM1患者的大多數(包括未報道的患者)。另一方麵，印度人的CTG頻率最高。> 18這與發現一致，即DM1在印度非常普遍。33然而，在我們的研究中，印度DM1患者的數量在三個亞人群中是最低的。這可能反映了社會經濟和人口統計學原因，以及各自亞人群中DM1的誤診/漏診。
我們的研究還首次提供了CTG的數據。> 18馬來人的等位基因頻率。與印度人相比，馬來族在基因上更像中國人。34比較(CTG)> 18然而，馬來人與印度人之間的相似性(p=0.8151)比華人(p=0.249)更大。對該地區其他現代馬來人進行同樣的分析，如新加坡馬來人和印度尼西亞人，以及土著馬來人，將是很有趣的。
單管TP-PCR的使用允許快速識別大致病性CTG重複序列，從而減少了基於Southern blot方法檢測或排除大擴增存在的需要。Southern blot可能需要大量的DNA，使用放射性物質，是耗時的。此外，該程序也不太敏感，可能難以複製。因此，任何減少Southern blot檢測數量，同時表現出高敏感性和特異性的方法在臨床環境中都是有利的。然而，所使用的TP-PCR測試需要高度專業化的設備，即遺傳分析儀，該設備可能尚未廣泛使用，無法估計超過85個重複的CTG擴增的大小。
迄今為止，DM1患者的基因型-表型相關性研究給出了相互矛盾的結果，提出了各種潛在的機製、關聯和理論。35-38特別是，在他們對DM1中擴展CTG重複序列的體細胞不穩定性的研究中，Morales等39表明沒有證據表明疾病的發病機製受限於一個閾值，超過該閾值重複長度與發病年齡無關。此外，他們還表明，發病年齡進一步受到軀體不穩定性水平的影響，這是一種高度遺傳的特征。在我們的研究中，我們發現中國家庭的基因型-表型相關性存在差異，患者3雖然攜帶350個重複，但基本上沒有症狀。她的疾病狀況是在她的孩子出生後才被懷疑和診斷的，她的孩子出現了症狀。她的兩個孩子都是先天性感染，這與之前的研究結果一致，即大多數先天性病例是由母體傳播的。另一方麵，患者2和7從父係遺傳了致病等位基因，導致經典/成人發病的DM1。患者8和9有相同的疾病表型。我們無法確定他們的疾病是否遺傳，因為他們的父母從未接受過檢測。但是，這些患者接受了遺傳谘詢，並根據道德原則，自主決定是否向有風險的家庭成員透露其疾病狀況，以便將來進行谘詢和檢測。還觀察到，先天性感染患者5表現出與經典感染患者相當的擴張大小。 The only symptoms he has shown, however, are neonatal hypotonia and a mild cognitive dysfunction. The comparable repeat size is most likely due to the younger age of patient 5 compared with the classically affected adults, and suggests that a larger repeat size would be observed, as the patient grows older. Apart from these disease dynamics, there have also been findings of contraction of allele sizes on transmission reported elsewhere.27，36所有這些因素都指向了DM1的高度複雜性，並說明了向受影響家庭提供遺傳谘詢服務的重要必要性。
分子檢測通常被確立為診斷遺傳疾病(如DM1)的金標準。這是因為分子檢測能夠迅速消除鑒別診斷，確認DM1診斷並估計患者CTG擴張的大小，從而避免了侵入性手術的需要，如肌肉活檢。希爾伯特等40他們研究了在美國國家登記處登記的一大群糖尿病患者，探索了他們的診斷曆程，平均需要7年才能做出正確的DM1診斷。這一延誤給患者及其家屬帶來了許多影響，從缺乏適當的疾病管理到錯過遺傳谘詢的機會。許多發展中國家的情況非常相似，甚至更糟，因為對DM1的分子診斷檢測不容易獲得。潛在地，可能有大量患者未被診斷/誤診，以及那些為了做出明確診斷而不必要地接受了各種調查的患者。
我們初步研究的結果可以幫助構建馬來西亞罕見疾病管理框架，使用DM1作為疾病模型。這裏提供的數據增加了東南亞地區DM1的稀缺文獻。的CTG重複長度信息DMPK基因，DM1專利，適當的臨床評估和具有成本效益的分子方法，對DM1的早期診斷和低資源環境下的遺傳谘詢具有意義。
致謝
作者對Juliana Lee的貢獻表示感謝，她為患者及其家人提供了遺傳谘詢和支持。作者還感謝UMMC血庫提供的對照血液樣本，以及DM1患者參與本研究。
參考文獻
腳注
KKA, TI和M-KT對手稿的貢獻相同。
貢獻者所有作者都參與了作品的構思和設計，以及提交的手稿的最終批準。KKA和TI參與了數據的獲取和分析，KKA, TI和M-KT參與了手稿的起草。LHL, KJG, KTW, AA-A和M-KT對手稿進行了批判性評估。
資金本研究由馬來西亞高等教育部資助(基礎研究資助計劃;資助號:FG029/2010A)，馬來亞大學研究生研究基金;資助號:PV126/2012A, UM HIR資助號:UM. c / 625 / 1 / HIR / MOHE / MED / 27)，馬來西亞罕見疾病協會的研究資助和馬來亞大學研究管理和監測研究所的Page Charge基金。
相互競爭的利益沒有宣布。
倫理批準開展本研究已獲得馬來亞大學醫學中心(UMMC)倫理委員會的倫理批準(參考編號577.17和800.6)。
出處和同行評審不是委托;外部同行評審。
數據共享聲明沒有其他數據可用。