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摘要
客觀的可靠的半定量評估組織學胎盤急性炎症是有問題的，甚至在專家之間。組織學切片上的組織樣本經常顯示中性粒細胞浸潤的範圍和位置的變化。我們試圖確定病理學家對胎盤中性粒細胞浸潤評分的可變性是否可以通過使用“感興趣區域”(roi)來減少，該方法將樣本分解為更小的成分。
設計在56名婦女的染色H&E切片中確定了roi。roi由至少兩個獨立的評分者使用半定量量表(0-4)對平均中性粒細胞數量進行評分。
設置耶魯紐黑文醫院早產單胞胎
參與者本研究使用56名單胎妊娠婦女的H&E染色胎盤載玻片，這些婦女在分娩後24小時內進行了臨床指征羊膜穿刺術。
主要和次要結果測量用類內相關係數(ICC)和對數線性回歸評估評分者之間的一致性。使用羊水蛋白質譜評分(中性粒細胞防禦素-2、中性粒細胞防禦素-1、鈣顆粒蛋白C和鈣顆粒蛋白A)評估預測有效性。
結果在感興趣的區域內，ICC對平均中性粒細胞評分發現了極好的一致性。對數線性分析表明，即使存在分歧，反應也沿對角線呈正相關。將病理學家的評分與羊水蛋白譜評分進行比較，也有強有力的證據證明預測有效性。
結論通過使用數字化roi的半定量中性粒細胞評分，觀察員之間的協議被證明是可行的，具有高信度和效度。
- 組織病理學
- 圍產期學
- 統計與研究方法
- 中性粒細胞
這是一篇開放獲取文章，根據創作共用屬性非商業(CC BY-NC 4.0)許可證發布，該許可證允許其他人以非商業方式分發、混音、改編、在此作品的基礎上進行構建，並以不同的條款許可其衍生作品，前提是原始作品被正確引用且使用是非商業性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/
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本研究的優勢和局限性
本研究評估了組織學胎盤急性炎症半定量組織學評分的可靠性和有效性。
使用組內相關係數和對數線性模型評估一致性。
對於妊娠<20周或> - 37周的胎盤，需要進一步的研究來評估這種方法。
目前還沒有開發出將利益區域的個人分數合並為單個彙總分數的方法，因此限製了該方法的實用性。
背景
羊膜內感染和炎症是早產的主要危險因素，也是導致腦癱、上呼吸道和下呼吸道疾病等重大兒童疾病發展的因素之一。1 - 6因此，其診斷需要在同一患者、患者和機構中重現，並且有效(一致預測感染的重要臨床特征，包括嚴重程度、持續時間和後遺症風險，如新生兒敗血症或更長期的結果)。我們采用了三種方法來確定羊膜內感染的存在和量化感染程度:(1)由產科醫生進行臨床評估7(2)測定母體血清中的炎症介質(細胞因子)水平8羊水8，9或者胎兒臍帶血8(3)胎盤組織學。10然而，這些方法之間有重要的區別。臨床評價敏感性和特異性較差，11導致可能從治療中受益的病例被遺漏，以及對健康妊娠的錯誤分類。雖然可能比臨床評估更敏感和特異性，但任何來源的細胞因子測量在技術上都是炎症的測量，而不是感染。重要的是，炎症可以由多種途徑引起，其中之一就是感染。10組織學胎盤急性炎症的評估依賴於用H&E染色的胎盤外膜、絨毛膜板、胎兒絨毛膜血管和臍帶標本中中性粒細胞數量的評估。12，13該方法已被視為胎盤評估的金標準，並使用半定量評分係統(例如，0,1,2和3;0,1,2,3和4)。13
不幸的是，目前診斷胎盤組織學的“金標準”既不可靠，也沒有針對生物學上有效的終點(如羊水或臍帶血蛋白質組學)進行驗證。最近的一份出版物闡明了這個問題。由6名評審員組成的小組提供了20張組織學切片，其中14張有與急性感染相關的病變。討論了幻燈片，但未能對其中6張幻燈片取得一致評分。這6張玻片被替換為6張病變相似的玻片，可以得到一致的結果。然後，同樣的20張幻燈片在病理學家中進行獨立評分。Kappa值為急性絨毛膜羊膜炎/母體炎症反應(任意0.93;重度0.76，晚期0.49);慢性(亞急性)絨毛膜羊膜炎(0.25)和急性絨毛膜羊膜炎/胎兒炎症反應(任何0.90;重度0.55，晚期0.52)。 By their own criteria, kappa values for anything other than a ‘present/absent’ code, any semiquantative score, had only fair–moderate agreement.14可靠地確定其存在和數量有助於更有效地預測風險。15此外，關於羊膜內感染情況下胎兒炎症反應嚴重程度的準確可靠的信息可能有助於新生兒護理。半定量組織學評分令人失望的可重複性，甚至在專家之間，已經損害了臨床有用性，限製了其在研究和臨床評價中的價值。
在這篇手稿中，我們描述了一種病理學家評估方法的結果，該方法顯著降低了病理學家評估的可變性，這是在該領域實現改進的半定量評估的第一步。為了準備開發一種使用圖像分析軟件檢測中性粒細胞的自動化算法，我們首先將幻燈片數字化，並使用圖像分割軟件創建更小的“感興趣區域”(ROIs)，以用於該算法的應用。在這樣做的過程中，一張幻燈片被細分為多個roi。然後，我們在比較單個ROI評級時，而不是比較整個“案例”的單個評級時，試圖估計(人類)評分者之間的一致性。我們的結果表明，僅通過這一簡單步驟就可以提高可靠性。正如方法部分所描述的，用於定義ROI的標準可能與可靠性的改進有關。當評估的視野受到限製時，一致性也可能得到增強，例如對單個ROI的評估而不是對完整幻燈片(包括多個不受限製的ROI)的評估，而不管ROI選擇的標準如何。下麵我們將更詳細地描述所使用的方法、病例以及可靠性是否隨著病例或組織特征而變化。
方法
所有婦女都有早產或早產胎膜早破的症狀。本亞研究的合格受試者符合以下標準:分娩時胎齡<37周的單胎胎兒，並經臨床指征羊膜穿刺術排除分娩後24小時內羊膜內感染。排除標準包括羊水缺乏、HIV或肝炎感染和胎兒狀態不穩定。孕齡根據孕20周前的超聲檢查確定。
羊膜穿刺術用於微生物學研究和評估羊水的炎症狀態是常規提供的。采用無菌技術和超聲引導進行羊膜穿刺術。羊水中的蛋白質譜被用來檢測一組與羊水炎症密切相關的四種蛋白質“標記物”，並基於這些蛋白質開發了一個評分，稱為羊水質量限製(AFMR)評分。AFMR評分是通過單表麵增強激光解吸電離飛行時間質譜儀從新鮮羊水中立即生成的。AFMR評分提供有關羊膜內炎症的定性信息。AFMR評分範圍從0到4，取決於四種蛋白質生物標誌物(中性粒細胞防禦素-2、中性粒細胞防禦素-1、鈣粒蛋白C和鈣粒蛋白A)的存在與否。如果存在特定峰值，則分類值為1，如果不存在則為0。16然而，在目前的研究中，我們也根據炎症的“嚴重程度”對研究人群進行了分層(AFMR=0表示“無”炎症;AFMR= 1-2表示“輕微”炎症，AFMR= 3-4表示“嚴重”炎症16，17)．
此外，早產婦女胎盤的組織學評估是常規的。在所有病例中，取一個從膜破裂區域延伸到胎盤邊緣的膜卷和每個樣本至少有兩條絨毛膜血管的絨毛膜板樣本。組織塊切片用H&E染色，並使用Aperio XT幻燈片數字化儀(Aperio, Vista, California, USA)進行數字化。本數據集僅限於那些在分娩後24小時內進行羊膜穿刺術的病例，以便在AFMR評分和組織病理學結果之間實現最佳相關性。在56個病例中，數字化的幻燈片文件由一名訓練有素的研究助理審查，該研究助理在所需組織中以20倍放大的速度捕獲roi。選擇ROI的標準是特定於組織類型的，如下所示。
母體胎盤外膜:活的(含有適當的嗜堿性核)區域，似乎垂直於膜平麵切割(非切線)，產生具有有效和一致的蛻膜、絨毛膜和羊膜樣本的roi。
母側絨毛膜板:絨毛膜板上有絨毛膜下纖維蛋白<絨毛膜板寬度50%的區域，結締組織，母側絨毛間血間隙與絨毛膜板表麵之間無絨毛膜血管。
臍帶血管:所有的臍帶血管，包括每個血管管腔與臍帶表麵距離最短的部分。
胎側絨毛膜板血管:包括絨毛膜板中從絨毛膜表麵到絨毛膜血管內皮的最短距離。
從56個案例中，我們總共收集了1591個roi。為了確保每一種組織類型都能被代表，我們將roi樣本按組織類型分層(母體胎盤外膜(n=713);母側絨毛膜板(n=124);絨毛膜板，胎兒側(n=109)和臍帶(n=645))。對於這四種胎盤組織類型中的每一種(母體胎盤外膜;絨毛膜板，母側;絨毛膜板血管，胎兒側和臍帶)，我們選擇了所有可用的roi或隨機的子樣本(數量較大的地方)，由至少兩名，在某些情況下，全部三名病理學家進行評估。對於絨毛膜板和胎兒絨毛膜板血管，選擇所有roi。對於母體胎盤外膜ROIs，我們根據AFMR評分(0、1、2、3和4)將ROIs分層，並隨機選擇每層的70%隨機分配給兩名病理學家。這種分層減少了需要複查的roi的數量，但仍然確保了炎症的變化。 The same method was used for the umbilical cord vessel ROIs. Of the 1591 ROIs available, 1051 were included in this analysis. The distribution of the included ROIs is as follows: maternal extraplacental membranes (n=448); chorionic plate, maternal side (n=119); chorionic plate, fetal side (n=73) and umbilical cord (n=412).
選擇的roi被隨機分配給三名從未在同一機構一起工作過的病理學家，對原始病例進行盲視。然後每個病理學家也被分配了其他兩個病理學家的一半roi。因此，對於每個選定的ROI，至少有兩位病理學家提供評分。在一個小樣本中，所有三位病理學家都提供了評分，因為我們中的一位(CS)審查了流行病學家從其他兩位病理學家審查的roi中隨機選擇的其他roi。總的來說，每個病理學家在4周的時間內審查了約600-650個roi。
利用組織中中性粒細胞平均數量的半定量量表對roi進行評分。例如，胎盤外羊膜中的中性粒細胞起源於蛻膜，而臍血管外沃頓膠中的胎兒中性粒細胞起源於血管腔。從起源部位遷移的距離，以確定母胎中性粒細胞的特定組織為代表，可能是感染持續時間的獨立反映。18測定中性粒細胞平均數量的刻度非常簡單;“0”表示“沒有確定為中性粒細胞的細胞”，“4”表示“中性粒細胞太多，無法計數”，1、2和3級留給病理學家判斷，將中性粒細胞數量劃分為四分之一。ROI被保留為.svs格式，因此每個ROI都可以通過ImageScope在ROI上從2倍放大到20倍放大。放大和掃描是留給每個病理學家的判斷。病理學家使用定製的數據輸入屏幕輸入每個ROI的分數，這樣就可以消除直接輸入電子表格的錯誤。雖然病理學家在這個評分項目中沒有接受過特殊培訓，但其中兩位(LE和CS)是由美國兒科病理學委員會認證的，而另一位(AC)也是由英國和澳大利亞皇家病理學學院認證的。
我們使用了類內相關係數(ICC)19，20.比較每對病理學家的半定量評分，在某些情況下，平均三個病理學家。icc衡量評級者之間的協議，允許兩個以上的評級者和兩個以上的分類類別。Kappa統計是ICC的一個子集，其中有兩個評分器和二分分類，因此在這裏不適用。此外，對數線性模型被用來描述每對評分者之間的一致模式。一係列越來越複雜的對數線性回歸模型擬合數據，目的是為每對評分者的分數確定最佳擬合模型。關於每個模型的詳細信息在其他地方有詳細描述。21，22簡而言之，每個模型都描述了一種不同的一致性模式(獨立、對角線、線性對線性、對角線加線性對線性、三角形和準獨立)。獨立性模型是最簡單的模型。該模型對數據的良好擬合表明，一個病理學家的反應與另一個病理學家的反應無關。對角線一致表示在主對角線上完全一致或一致。線性的線性關聯表明兩個病理學家的評分之間呈正相關。對角線加線性的線性關聯表明存在完全一致(即，沿主對角線一致)和不一致的應答對呈正相關的趨勢。其他模式包括三角協議和準獨立。通過確定最佳擬合和最簡約的模型，選擇最能描述當前協議類型和數量的模型。21，22偏差(G2)對每個日益複雜的模型進行似然比檢驗。如果似然比檢驗不顯著，(例如，更複雜的模型沒有顯著提高模型擬合)，更簡約的模型被認為是最好的描述一致模式。
結果
圖1是每對審稿人的ROI分數的圖形表示。圓圈的大小與該圓圈所代表的roi數量直接相關。圓圈越大，表示的roi越多。最大的圓通常是在對角線上，在對角線上，一對審稿人之間有完美的一致，或者在對角線外，在對角線上，兩對審稿人之間隻有一個數字的差異(例如，一個審稿人給出2分，另一個審稿人給出3分)。平均得分的ICCs是根據組織類型和胎齡類別計算的，也包括整體的ICCs。表1)．對於平均得分，ICCs是優秀的，並且在大多數組織類型中變化不大。絨毛膜板血管的ICC(胎兒炎症反應)低於其他類別，但仍良好(ICC>0.75)。20周或20周以上胎齡的ICCs也較高。妊娠20周或更早時，胎盤的ICC顯著降低(ICC=0.45)。
每對病理學家的組織學評分之間的一致性的圖形表示。組織學評分範圍從0到4，分數越高代表炎症程度越高。圓圈的大小與該圓圈所代表的感興趣區域(roi)的數量直接相關。圓圈越大，表示的roi越多。圓圈旁邊的小數字是由圓圈表示的roi的數量。
盡管上述幾個子組的一致性較低，對數線性模型比較分數表明，每對評分者的平均分是正相關的，或評分者之間有確切的一致，以及對不一致對的正相關反應(表2)．平均分數的比較表明，評分者1和評分者2之間存在線性的線性關聯。當評分者1、3和評分者2、3的評分進行比較時，我們發現對角線一致加上線性關聯。換句話說，評分者之間是完全一致的，但當有分歧時，不一致的對仍然是正相關的。
AFMR評分的分布(按病例報告，但分配到相關的ROI的情況下)由ROI組織學評分圖2．我們將AFMR評分與每位病理學家的ROI平均評分進行了比較。每個病理學家的評分與AFMR評分之間的相關性是不變的。的χ2與AFMR評分相比，該檢驗對所有三位病理學家都具有高度顯著性(p<0.0001)，線性關聯檢驗(p<0.0001)也是如此。大約20%的roi和AFMR分數完全一致。大多數roi都是單獨評分的，並且不了解同一病例中其他roi的評分，在AFMR(衡量一個整體過程)上的評分高於病理學家，而病理學家在本研究設計中必須對病例進行分段評分。大約40%的配對隻高出一個類別(例如，3而不是2)。
從每個病理學家的羊水質量限製評分(AFMR)和組織學評分之間的協議的圖形表示。圓圈的大小與該圓圈所代表的感興趣區域(roi)的數量直接相關。圓圈越大，表示roi的數量越多。圓圈旁邊的小數字是由圓圈表示的roi的數量。AFMR評分範圍從0到4，其中評分越高代表炎症越嚴重。同樣，組織學評分範圍從0到4，分數越高代表炎症程度越高。
討論
本研究發現，通過將視野縮小到較小的ROI，我們可以顯著提高病理學家對母體和胎兒中性粒細胞浸潤的半定量評分的可靠性。此外，我們證明了病例AFMR評分和病理學家的個體roi評分之間的線性一致。總之，這些結果表明，使用傳統評分方法缺乏可靠性，可能源於在查看整個幻燈片而不是單個ROI時所必需的心理總結。
與胎兒炎症相關的發病率和死亡率要求開發能夠提供可靠和精確的半定量組織學測量急性羊膜內感染的母體和胎兒炎症反應的措施。23，24胎兒炎症反應，定義為臍帶血和胎盤臍和絨毛膜血管炎中炎症細胞因子水平升高，預測早產的複發風險25，26除了死亡風險27腦癱,4兒童哮喘和肺損傷比較普遍。2，3.臍帶血細胞因子水平與胎兒中性粒細胞浸潤臍帶和絨毛膜板胎兒血管高度相關。28
我們已經確定了一種臨床可行的方法，以減少病理學家評估的可變性。然而，目前的方法是有限的，因為我們和其他人還沒有確定最佳的方法，將ROI評分合並為代表臨床有意義結果的單一總結評分。因此，下一步必然需要發展某種“加權平均”;我們的數據表明，在製定“病例評分”時，一個考慮因素可能是具有中性粒細胞的ROI數量，以及每個ROI中中性粒細胞的數量和評分。了解不同組織和不同個體(母體和胎兒炎症)的得分之間的關係，以及該病例的蛋白質組學，可能有助於我們改進病理學家的評估，以及使用數字化數據的算法自動化評分的未來努力。
研究結果的實用性也受到妊娠<20周胎盤的低ICC的限製。目前還不清楚為什麼這一組的ICC比晚胎齡的低。然而，在該組中，幾乎沒有胎盤對roi的總數有貢獻。最後，雖然評估了1000多個ROIs，但本研究中使用的胎盤相對較少，且均為早產。因此，目前還不清楚人口多樣性是如何促成這些發現的。需要進一步的研究來檢查晚胎齡(足月出生)對ICC的影響。
總之，目前的組織學工具隻有在對胎盤急性組織學炎症的複雜生理學進行“存在/不存在”分類時，即使是在“專家”之間，才顯示出出色的再現性。我們已經證明，通過簡單地數字化載玻片和限製病理學家的視野，可以將組織浸潤中中性粒細胞數量的半定量評分的可靠性提高到可接受的水平。我們建議評分可變性是基於細胞和組織樣本的自然異質性，以及目前評分的要求，即病理學家必須在心裏總結整個幻燈片及其所有可變性，並在一個或幾個組織樣本中提供一個單一的評分。此外，我們報告病理學家評估和蛋白質組學評分之間的聯係，這預示著該領域測量的未來發展。在未來的工作中，我們將進一步研究這些半定量評分的預測有效性(例如，在一個病例中使用所有ROI評分分析與蛋白質組學一致的模式)，並改進圖像處理算法，為胎盤急性炎症的組織學評估(即胎盤組織中的中性粒細胞數量)提供可靠的量化。我們的目標是采用這些工具，並對病理學專家和更具體的、生物學上有意義的終點進行驗證，這些終點與考慮產婦、胎兒-新生兒和兒童健康密切相關。
參考文獻
腳注
貢獻者DM和CS構思並協調了這項研究。JKS, DM和CS參與了研究的設計並起草了手稿。LE、CS和AC對羊水感染的組織學參數進行了定量分析。SV準備了幻燈片。DM, SG, GD和JKS進行了概念化和統計分析。IB、CB和CS為研究提供了數據、試劑和材料。所有作者都閱讀並批準了最終的手稿。
資金這項工作得到了小企業創新研究(SBIR)撥款的支持，來自美國國立衛生研究院的“胎盤病理學:數字評估和驗證”(CS，撥款號R43HD062307-01)。
免責聲明資金來源在這篇手稿的寫作中沒有任何作用。
相互競爭的利益沒有宣布。
倫理批準這項研究使用了來自56名婦女的匿名數據和幻燈片，這些婦女是2004年5月至2007年1月在耶魯大學紐黑文醫院分娩時一項更大研究的一部分。這項研究得到了耶魯大學機構審查委員會的批準。本研究僅使用匿名數據和幻燈片。沒有與研究參與者進行接觸。因此，本研究被豁免。
出處和同行評審不是委托;外部同行評審。
數據共享聲明本研究的數據是作為SBIR R43HD062307-01的一部分生成的，該基金的PI可以通過carolyn.salafia@gmail.com聯係。