羊膜內感染和炎症是早產的主要危險因素，也是腦癱、上呼吸道和下呼吸道疾病等重大兒童疾病發展的一個因素。 1 - 6因此，其診斷需要在同一患者、患者和機構之間具有可重複性和有效性(一致地預測感染的重要臨床特征，包括嚴重程度、持續時間和後遺症風險，如新生兒敗血症或長期結局)。確定羊膜內感染存在和量化羊膜內感染程度的方法有三種:(1)由產科醫生進行臨床評估 7(2)檢測母體血清中炎症介質(“細胞因子”)的水平 8羊水 8 9或者胎兒臍帶血 8(3)胎盤組織學。 10然而，這些方法之間有重要的區別。臨床評估敏感性和特異性較差; 11導致可能受益於治療的漏診病例，以及對健康妊娠的錯誤分類。雖然可能比臨床評估更敏感和特異性，但任何來源的細胞因子測量在技術上都是炎症而不是感染的測量。重要的是，炎症可以由多種途徑引起，其中之一就是感染。 10組織學上胎盤急性炎症的評估取決於胎盤外膜、絨毛膜板、胎兒絨毛膜血管和臍帶的H&E染色玻片中中性粒細胞數量的評估。 12 13該方法已被視為胎盤評估的金標準，並使用半定量評分係統(例如，0、1、2和3;0、1、2、3和4)。 13

不幸的是，目前診斷胎盤組織學的“金標準”既不可靠，也沒有經過生物學上有效的終點(如羊水或臍帶血蛋白質組學)的驗證。最近的一份出版物闡明了這個問題。一個由6名審稿人組成的小組提供了20張組織學切片，其中14張有與急性感染有關的病變。對幻燈片進行了討論，但無法對其中6張幻燈片獲得一致的評分。這六張幻燈片被替換為六張類似病變的幻燈片，可以獲得這樣的共識。然後將同樣的20張幻燈片分發給病理學家進行獨立評分。Kappa值為急性絨毛膜羊膜炎/母體炎症反應(任何0.93;重度0.76，晚期0.49);慢性(亞急性)絨毛膜羊膜炎(0.25)和急性絨毛膜羊膜炎/胎兒炎症反應(任何0.90;重度0.55，晚期0.52)。 By their own criteria, kappa values for anything other than a ‘present/absent’ code, any semiquantative score, had only fair–moderate agreement. 14可靠地確定其存在和數量有助於更有效地預測風險。 15此外，在羊膜內感染的情況下，關於胎兒炎症反應嚴重程度的準確和可靠的信息可能有助於新生兒護理。半定量組織學評分令人失望的再現性，甚至在專家中，已經損害了臨床有用性，限製了其在研究和臨床評估中的價值。

在這份手稿中，我們描述了病理學家評估方法的結果，該方法顯著降低了病理學家評估的可變性，這是在該領域實現改進的半定量評估的第一步。為了準備開發使用圖像分析軟件檢測中性粒細胞的自動算法，我們首先將幻燈片數字化，並使用圖像分割軟件創建較小的“感興趣區域”(roi)，以應用該算法。這樣一來，一張幻燈片被細分為多個roi。然後，當比較單個ROI的評級而不是整個“案例”的單一評級時，我們試圖估計(人類)評級者之間的一致性。我們的結果表明，僅通過這個簡單的步驟就可以提高可靠性。正如將在方法部分描述的那樣，用於定義ROI的標準可能與可靠性的改進有關。當評估的視野有限時，也可能會增強一致性，例如對單個ROI的評估，而不是對整個幻燈片(由多個不受限製的ROI組成)的評估，而不管ROI選擇的標準如何。我們將在下麵更詳細地描述所使用的方法、病例以及可靠性是否隨病例或組織特征而變化。

所有婦女均表現出早產或胎膜早破的症狀。本亞研究的合格受試者符合以下標準:分娩時胎齡<37周的單胎胎兒，並在分娩後24小時內進行臨床指征羊膜穿刺術以排除羊膜內感染。排除標準包括羊水無、HIV或肝炎感染和胎兒狀態不穩定。孕周前通過超聲檢查確定胎齡。

羊膜穿刺術用於微生物學研究和評估羊水的炎症狀態是常規的。羊膜穿刺術采用無菌技術和超聲引導。羊水中的蛋白質譜被用來檢測羊水中與炎症密切相關的一組四種蛋白質“標記物”，並根據這些蛋白質建立一個評分，稱為羊水質量限製(AFMR)評分。使用單表麵增強激光解吸電離飛行時間質譜儀，立即從新鮮羊水中生成AFMR評分。AFMR評分提供了羊膜內炎症的定性信息。AFMR評分範圍從0到4，這取決於四種蛋白質生物標誌物(中性粒細胞防禦素-2、中性粒細胞防禦素-1、鈣粒蛋白C和鈣粒蛋白A)的存在與否。如果存在一個特定的峰值，則分類值為1，如果不存在則為0。 16然而，在目前的調查中，我們還根據炎症的“嚴重程度”對研究人群進行了分層(AFMR=0表示“無”炎症;AFMR= 1-2表示“輕度”炎症，AFMR= 3-4表示“嚴重”炎症 16 17）.

此外，胎盤的組織學評估在早產婦女中是常規的。在所有病例中，從膜破裂區域延伸到胎盤邊緣的膜卷和每個樣本至少有兩個絨毛膜血管的絨毛膜板樣本。組織塊切片用H&E染色，並使用Aperio XT玻片數字化儀(Aperio, Vista, California, USA)進行數字化。該數據集僅限於在分娩後24小時內進行羊膜穿刺術的病例，以使AFMR評分與組織病理學結果之間具有最佳相關性。從56個病例中，經過培訓的研究助理對數字化幻燈片文件進行了審查，以在必要的組織中以20倍的放大倍率捕獲roi。選擇ROI的標準是特定於組織類型的，如下所列。

母體胎盤外膜:活的(含有適當的嗜堿性核)區域，似乎與膜平麵垂直(非切向)切割，產生具有有效和一致的蛻膜、絨毛膜和羊膜樣品的roi。

從56個案例中，我們共收集到1591個roi。為了確保每種組織類型都有代表性，我們按組織類型對roi樣本進行分層(母體胎盤外膜(n=713);母側絨毛膜板(n=124);絨毛膜板，胎兒側(n=109)和臍帶(n=645))。對於這四種胎盤組織類型(母體胎盤外膜;絨毛膜板，母體一側;絨毛膜板血管，胎兒側和臍帶)，我們選擇了所有可用的roi或隨機子樣本(其中數字較大)，由至少兩名，在某些情況下全部三名病理學家評估。對於絨毛膜板和胎兒絨毛膜板血管，選擇所有roi。對於母體胎盤外膜roi，我們根據AFMR評分(0、1、2、3和4)對roi進行分層，並隨機選擇每個層的70%隨機分配給兩名病理學家。這種分層減少了必須審查的roi的數量，但仍然保證了炎症的變化。 The same method was used for the umbilical cord vessel ROIs. Of the 1591 ROIs available, 1051 were included in this analysis. The distribution of the included ROIs is as follows: maternal extraplacental membranes (n=448); chorionic plate, maternal side (n=119); chorionic plate, fetal side (n=73) and umbilical cord (n=412).

所選的roi被隨機分配給三名從未在同一機構一起執業的病理學家，並對起源病例進行盲法。然後，每位病理學家也被分配到其他兩位病理學家的roi的一半。因此，對於選擇的每個ROI，至少有兩位病理學家提供評分。在一個小樣本中，所有三名病理學家都提供了分數，其中一名(CS)審查了流行病學家從其他兩名病理學家審查的roi中隨機選擇的額外roi。在4周的時間內，每位病理學家總共審查了~ 600-650個roi。

使用半定量量表對組織中中性粒細胞的平均數量進行roi評分。例如，胎盤外羊膜中的中性粒細胞起源於蛻膜，而臍帶血管外沃頓氏水母中的胎兒中性粒細胞起源於血管腔。從起源處遷移的距離，作為鑒定出母體或胎兒中性粒細胞的特定組織的代表，可能是感染持續時間的獨立反映。 18測定中性粒細胞平均數目的尺度很簡單;“0”表示“沒有確定為中性粒細胞的細胞”，“4”表示“中性粒細胞太多，無法計數”，1、2和3級留給病理學家判斷，以中性粒細胞數量劃分為四分位數。ROI保留為.svs格式，因此ImageScope可以操作每個ROI，將ROI的放大倍數從2倍移動到20倍。放大和掃描留給每位病理學家判斷。定製的數據輸入屏幕用於病理學家輸入每個ROI的分數，以便消除直接輸入電子表格的錯誤。雖然病理學家在這個評分項目中沒有接受過特殊的培訓，但其中兩名(LE和CS)獲得了美國兒科病理學委員會的認證，而另一名(AC)同樣獲得了英國和澳大利亞皇家病理學學院的認證。

我們使用了類內相關係數(ICC) 19 20.比較每一對病理學家的半定量評分，在某些情況下，平均是三個病理學家。國際商會衡量評級機構之間的協議，允許兩個以上的評級機構和兩個以上的分類類別。Kappa統計是ICC的一個子集，其中有兩個評分者和二分類，因此在這裏不適用。此外，采用對數線性模型來描述每對評分者之間的一致模式。對數據擬合了一係列越來越複雜的對數線性回歸模型，目的是為每對評分者的分數確定最佳擬合模型。每個模型的細節在其他地方有詳細描述。 21 22簡而言之，每個模型描述了一種不同的一致性模式(獨立、對角線、線性與線性、對角線加線性與線性、三角形和準獨立)。獨立模型是最簡單的模型。該模型與數據的良好擬合表明，一個病理學家的反應與另一個病理學家的反應無關。對角線一致表示主對角線完全一致或一致。線性逐線性關聯表明兩名病理學家的評分呈正相關。對角線加線性由線性關聯表明存在精確的協議(即，沿主對角線的協議)和不一致的應答者對積極相關的趨勢。其他模式包括三角協議和準獨立。通過確定最佳擬合和最簡約的模型，選擇最能描述當前協議類型和數量的模型。 21 22偏差(G²)，采用似然比檢驗比較各模型的差異。如果似然比檢驗不顯著(例如，更複雜的模型不能顯著改善模型擬合)，則認為更簡潔的模型最能描述一致性模式。

圖1是每一對評論者的ROI分數的圖形表示。圓圈的大小與圓圈所代表的roi的數量直接相關。圓圈越大，所代表的roi就越多。最大的圓圈通常沿著對角線，在一對審稿人之間有完全一致的地方，或者隻是在對角線外，一對審稿人隻相差一個數字(例如，一位審稿人給出了2分，另一位審稿人給出了3分)。平均得分的ICCs是根據組織類型和胎齡類別計算的整體和分層( 表1）.對於平均得分，ICCs是優秀的，並且在大多數組織類型中變化不大。絨毛膜板血管(胎兒炎症反應)的ICC低於其他類別，但仍然良好(ICC>0.75)。妊娠20周及以上的ICCs也較高。妊娠20周或更早胎盤ICC顯著降低(ICC=0.45)。

盡管上述幾個亞組的一致性較低，但比較分數的對數線性模型表明，每對評分者的平均分數呈正相關或在評分者之間具有精確的一致性，以及不一致對的正相關反應( 表2）.平均分數的比較表明，評分者1和評分者2之間存在線性的線性關聯。當評分者1和3的分數以及評分者2和3的分數進行比較時，我們發現對角線一致加上線性的線性關聯。換句話說，評分者之間是完全一致的，但當存在分歧時，不一致的對仍然是正相關的。

根據ROI組織學評分，AFMR評分的分布(按病例報告，但分配給相關的ROI)呈現在 圖2．我們將AFMR得分與每個病理學家的ROI平均得分進行比較。每位病理學家的評分與AFMR評分之間的關聯是不變的。的χ²與AFMR評分相比，三名病理學家的測試結果都非常顯著(p<0.0001)，線性逐線性關聯測試結果也非常顯著(p<0.0001)。大約20%的roi和AFMR分數完全一致。大多數roi，每個單獨得分，不知道同一病例中其他roi的得分，在AFMR(測量全局過程)上的得分高於病理學家，他們必須在本研究設計中對病例進行分段評分。大約40%的配對隻高出一個類別(例如，3而不是2)。

本研究發現，通過將視野縮小到更小的ROI，我們可以顯著提高病理學家對母胎中性粒細胞浸潤進行半定量評分的評分間可靠性。此外，我們證明了病例AFMR評分和病理學家個人roi評分之間的線性一致。總之，這些結果表明，使用傳統的評分方法缺乏可靠性，可能源於在查看整個幻燈片而不是單個ROI時所必需的心理總和。

與胎兒炎症相關的發病率和死亡率要求發展能夠提供可靠和精確的半定量組織學測量急性羊膜內感染時母體和胎兒炎症反應的措施。 23 24胎兒炎症反應，定義為臍帶血中炎性細胞因子水平升高以及胎盤臍帶和絨毛膜血管炎，預測早產複發的風險 25 26除了死亡的風險 27腦癱, 4兒童哮喘和肺損傷更普遍。 2 3.臍帶血細胞因子水平與胎兒臍帶和絨毛膜板血管中性粒細胞浸潤高度相關。 28

我們已經確定了一種臨床可行的方法來減少病理評估的可變性。然而，目前的方法是有限的，因為我們和其他人尚未確定將ROI得分合並為一個代表臨床有意義結果的單一彙總得分的最佳方法。因此，下一步必然需要發展某種“加權平均”;我們的數據表明，在製定“病例評分”時，一個考慮因素可能是帶有中性粒細胞的ROI的數量，以及每個ROI中中性粒細胞的數量和評分。了解不同組織和不同個體(母體與胎兒炎症)的評分與該病例的蛋白質組學之間的關係，可能有助於我們改進病理學家的評估，並在未來使用數字化數據的算法實現自動評分。

研究結果的實用性也受到妊娠<20周胎盤ICC低的限製。目前尚不清楚為什麼這一組的ICC低於孕齡後期。然而，在這組中，很少有胎盤對總roi的貢獻。最後，雖然評估了超過1000個roi，但本研究中使用的胎盤相對較少，而且都是早產兒。因此，目前還不清楚人口的變化是如何促成這些發現的。將需要進一步的研究來檢查較晚胎齡(足月分娩)對ICC的影響。

總之，目前的組織學工具隻有在使用“存在/不存在”的組織學胎盤急性炎症複雜生理分類時才顯示出良好的再現性，即使在“專家”中也是如此。我們已經證明，通過簡單地將切片數字化並限製病理學家的視野，可以將組織浸潤中中性粒細胞數量的半定量評分的可靠性提高到可接受的水平。我們建議，評分的可變性是基於細胞和組織樣本的自然異質性，以及目前對評分的要求，即病理學家必須在心理上總結整個切片及其所有可變性，並在一個或幾個組織樣本中提供一個單一的評分。此外，我們報告了病理學家評估和蛋白質組學評分之間的關聯，這預示著該領域測量的未來發展。在未來的工作中，我們將進一步研究這些半定量評分的預測有效性(例如，分析一個病例中所有ROI評分與蛋白質組學的一致模式)，並改進圖像處理算法，為胎盤急性炎症的組織學評估(即胎盤組織中的中性粒細胞數量)提供可靠的量化。我們的目標是采用這些工具，並通過病理學專家和更具體和有生物學意義的終點來驗證它們，這些終點與孕產婦、胎兒、新生兒和兒童健康的考慮密切相關。