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摘要
目的鹽敏感性係統流行病學(EpiSS)研究旨在結合分子生物學、流行病學和生物信息學方法，利用基因組中的單核苷酸多態性和轉錄組中的非編碼rna，發現SSBP的遺傳和環境因素，發現鹽敏感性血壓(SSBP)的潛在原因。
參與者2014年7月至2016年7月，我們從北京和遼寧省的11個研究中心招募了成年人;參與者為漢族人口，年齡在35-70歲之間。通過使用標準化問卷進行麵對麵訪談，我們收集了血液樣本、現場尿樣和24小時尿樣，此外還收集了人口統計學、健康相關生活方式因素、慢性疾病、家族史和人體測量信息等基線數據。EpiSS采用改良的Sullivan急性口服鹽水負荷和利尿收縮試驗(MSAOSL-DST)評估鹽對血壓的影響。
迄今為止的發現總共有2163名參與者被納入EpiSS，其中2144名參與者完成了問卷調查，2120名(98.0%)完成了MSAOSL-DST, 2083名(96.3%)提供了24小時尿樣。共有2057名參與者(1501名女性和556名男性)完成了調查的所有步驟，並被納入分析。其中583例(28.3%)受試者為鹽敏感血壓，1061例(51.6%)受試者為高血壓。
未來的計劃我們研究的下一步是評估參與者心血管疾病的發病率。每兩年隨訪一次，包括麵對麵問卷調查、實驗室測量血液、尿肌酐、腎小球濾過率和人體測量，將額外進行兩次。DNA和RNA將被收集用於後續的遺傳生物標誌物研究。我們計劃基於相關環境危險因素篩選鹽敏感相關基因位點和非編碼rna。
試用注冊號chictr -曲線端- 16009980;Pre-results。
- 血壓
- 膳食鈉
- 基因
- 鹽敏感性
- 流行病學
這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名非商業(CC BY-NC 4.0)許可證發布，該許可證允許其他人以非商業方式分發、混音、改編、在此基礎上進行構建，並以不同的條款許可其衍生作品，前提是正確引用原始作品，給予適當的榮譽，任何更改都已注明，並且使用是非商業性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/．
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本研究的優勢和局限性
在整個研究方案中，采用係統流行病學方法進行登記和質量控製，以分析鹽對血壓影響的綜合危險因素。訓練有素的研究人員使用統一和標準化的數據收集和實驗室測試方法。
鹽敏感性的係統流行病學(EpiSS)研究旨在包括高血壓患者，並同時將這些患者與健康參與者進行比較，以便結果足以得出進一步的結論。
據我們所知，北京和遼寧地區尚無鹽敏感人群分布頻率的研究，而EpiSS是國內最大的采用改良Sullivan急性口服鹽負荷和利尿收縮試驗的鹽敏感研究。
受試者自願參與這項研究;我們沒有使用隨機抽樣的方法。此外，社區老年婦女較多。因此，我們的參與者可能不代表一般人群。
由於後勤原因和資金不足，我們無法在基線調查中評估腎小球濾過率和肌酐。我們將在後續的跟進中對這兩個指標進行評估。
簡介
高血壓是一種由遺傳和環境因素共同引起的複雜疾病。根據世界衛生組織的數據，2008年，高血壓影響了全球超過10億人1導致2010年940萬人死亡。2到2025年，預計全球高血壓患病率將增加60%，達到15.6億例。3.由於高血壓的高患病率和隨之而來的心血管和腎髒疾病風險的增加，高血壓對全球公共衛生構成了巨大的挑戰。
之前的研究發現，家族病史、遺傳易感性、超重或肥胖，4個5過量的鹽攝入6過度飲酒7是高血壓的危險因素。8
大量研究表明，在環境因素中，高鹽攝入是導致血壓升高的最重要危險因素之一。9 - 11鹽間研究證明了鈉攝入量和血壓之間的因果關係，該研究包括位於32個國家的52個研究中心。12與鹽間期研究結果相似，大多數與鹽攝入相關的流行病學研究均顯示鈉攝入量與血壓呈正相關;然而，即使采用相同的飲食鈉幹預，個體之間的血壓反應也會有很大差異，這種現象被稱為血壓鹽敏感性(SSBP)。13SSBP的定義最早由Kawasaki提出等因為高鹽攝入導致血壓升高。14最近，SSBP被認為是一種持續的生理特征。15日16研究表明，鹽敏感是高血壓的一種中間遺傳表型17它是心血管事件的獨立危險因素，也是高血壓和正常血壓患者總死亡率的有力預測因子。182005年，美國高血壓學會指出，鹽對血壓的影響是早期高血壓損害的標誌。19鹽效應的早期識別和診斷有助於預防鹽敏感性高血壓的發生，並有助於高危人群的個體減鹽過程。20.
鹽敏感性的檢測是預防和治療高血壓的關鍵。評價方法包括長期飲食鹽攝入量(可能需要數周)、急性靜脈輸注2 L生理鹽水(4小時)、冷加壓試驗等15；然而，目前還沒有準確、規範的評價方法。1978年，Luft等率先使用了快速加鹽(靜脈輸注後4小時內加2升生理鹽水)與減鈉(10 mmol Na)相結合的方法+，呋塞米40毫克，口服，每日三次)，以確定鹽敏感性。17從那時起，研究人員進行了大量的研究，使用各種方法和標準來確定鹽敏感性。在這些研究中，鹽負荷從10 mmol/天到340 mmol/天不等，測試時間從4小時到28天不等。14 21 22一些研究使用幹預前後血壓的絕對值來確定鹽敏感性，而另一些研究則使用血壓變化的相對值來確定鹽敏感性。14 23 24因此，不同的研究設計和不兼容的測定標準導致數據集不足，無法得出關於鹽對血壓影響的有力結論。因此，建立一種能夠快速、準確篩查鹽對血壓影響的方法非常重要。
遺傳變異在鹽敏感性中也起著重要作用，25包括腎素-血管緊張素-醛固酮係統的變化，26離子和水通道，轉運體和交換器係統，如內皮鈉通道，27內皮係統，28細胞內信使係統，29交感神經係統，30 31apelin-APJ係統32還有利鈉肽和激肽-激肽係統。33這一發現表明，有可能發現遺傳生物標記物，以幫助確定鹽對血壓的影響。
為了在早期預防高血壓的發生，能夠充分了解鹽對人群血壓的影響及其環境和遺傳危險因素是很重要的。係統流行病學是一種新的流行病學方法，它著眼於多個層麵的因果關係(例如，社會人口學、臨床、生物學)，並結合多種暴露測量，使用基因組學、代謝組學、轉錄組學、脂質組學和RNomics方法等來識別風險，分析風險因素之間的相互關係。34
隨著精準醫療和新一代測序技術的快速發展，基因組和轉錄組在病因複雜的慢性疾病發病機製中的作用日益受到關注。多重組學的結合將有助於發現疾病的主要靶點，並能夠評估受各種環境特征影響的遺傳因素的影響，這可能有助於疾病的預防和治療。因此，在中國北方漢族人群中采用係統流行病學方法，建立EpiSS隊列研究，結合分子生物學、流行病學和生物信息學方法，利用基因組中的單核苷酸多態性(SNPs)和轉錄組中的非編碼rna來研究SSBP的潛在原因，以闡明影響SSBP的遺傳和環境因素。據我們所知，EpiSS是中國最大的使用改良Sullivan急性口服鹽水負荷和利尿收縮試驗(MSAOSL-DST)的鹽敏感性研究。
隊列描述
在2014年7月至2016年7月期間，受試者從北京的11個研究中心(5個社區衛生中心)和遼寧省的一個代表性城市(6個社區衛生中心)招募，後者通常被認為是中國北方的高鈉攝入地區。我們的研究地點的選擇是按行政區域的地區分層的。選取各區有能力開展調查且配合良好的社區中心作為研究地點。SSBP在高血壓和正常患者中的患病率分別為50%和42%。15根據隊列研究的樣本量方程，我們要求兩組至少814名受試者，α=0.05， β=0.10。總樣本量為1791例，估計隨訪丟失10%。
所有在選定社區生活5年以上、年齡在35歲至70歲之間的人都被采訪並自願參與。此外，所有的參與者都是漢族人，並且是獨立的。研究人群的詳細納入和排除標準列於表1而且表2．該過程的詳細信息顯示在圖1，包括問卷調查，人體測量，MSAOSL-DST，以及收集24小時尿液和血液樣本。考慮到降壓藥的半衰期，要求高血壓患者停止所有降壓藥的攝入至少24小時，遵循自願原則。我們記錄了調查當天的用藥和停藥情況，並剔除了服藥者。此外，所有受試者在測試前至少禁食8小時。
改良Sullivan急性口服鹽水負荷及利尿收縮試驗(MSAOSL-DST)過程。
問卷調查
在訓練有素的研究人員的指導下，參與者通過麵對麵的訪談完成了結構化的問卷調查。收集的信息包括社會人口學信息(年齡、性別、種族、婚姻狀況、教育程度、職業等)、與健康相關的生活方式信息(吸煙狀況、飲酒情況、體育鍛煉和飲食習慣)、自我報告的慢性疾病(高血壓和糖尿病)、藥物使用史和家族史(高血壓、糖尿病、心血管疾病和癌症)。
人體測量數據
訓練有素的考官對每個參與者進行了簡單的標準化人體測量。這些測量包括身高、體重、腰圍和臀圍。參與者被要求脫下鞋子和外套進行測量。腰臀比定義為腰圍(厘米)除以臀圍(厘米)。體重指數(BMI)定義為體重(kg)除以身高(m)的平方2)．肥胖定義為BMI為28 kg/m2或更高版本。35
使用自動血壓計(歐姆龍HEM-7118，日本)，采用美國心髒協會的方法測量血壓。36在坐姿休息5分鍾後，測量血壓兩次，兩次測量之間間隔1分鍾。取平均值作為最終血壓值。37如果兩個血壓值之間的差異大於5mm Hg，則在額外的1分鍾間隔後進行第三次測量，並將最後兩次測量的平均值記錄為血壓。
根據2010年《中國高血壓治療指南》，高血壓的診斷標準是收縮壓(SBP)≥140 mm Hg和/或舒張壓(DBP)≥90 mm Hg，被診斷為高血壓或在過去2周內服用過降壓藥。38
MSAOSL-DST與血壓鹽敏感性的關係
我們使用MSAOSL-DST來評估SSBP，它是由Sullivan首先使用的，39然後由Ym修改等1994年將其應用於大規模人群進行流行病學調查。40
根據MSAOSL-DST，受試者在30分鍾內口服1000 mL 0.9%生理鹽水溶液(圖1)．然後測量血壓三次，如下:(1)基線血壓，(2)鈉負荷後2小時，(3)利尿減少(40mg)後2小時。3個平均動脈壓(MAP)值(MAP1、地圖2和地圖3.)根據相應的收縮壓和舒張壓計算。MAP定義為DBP加上三分之一的脈壓。MAP患者2−地圖1≥5mm Hg或MAP3.−地圖2≤- 10 mm Hg被診斷為鹽敏感，其他患者被定義為耐鹽。40
尿樣
采集了兩種尿樣:斑點尿和24小時尿。在基線、鹽負荷試驗後2小時和速尿劑量後2小時收集現場尿液樣本。
在MSAOSL-DST測試後1周采集24小時尿液樣本，期間鈉攝入量正常。根據世衛組織關於減少鹽攝入戰略的區域協商，41所有參與者都被要求丟棄當天第一次排空的尿液，然後在接下來的24小時內收集所有尿液樣本，包括第二天早上第一次排空的尿液。每個參與者都得到一個5升帶蓋的塑料容器。為了評估24小時尿樣的完整性，小於500ml的尿樣被定義為無效樣本。42
所有尿液樣本都使用離子選擇電極法測量尿液鈉和鉀濃度，由Cobas C8000分析儀(Roche, Basel, Switzerland)自動執行。
根據24小時尿鈉排泄量，評估每日鹽攝入量的公式如下41：
24hUNaE=24小時尿鈉+排泄值(mmol/L)
24hUV=24小時尿量(L)
米=分子質量
血液樣本
在禁食8小時後的清晨采集了血液樣本。訓練有素的護士使用含有EDTA或凝結劑的真空管從肘前靜脈采集血液樣本。血液樣本立即儲存在保溫容器中，並在- 80°C下離心、攪拌和儲存。采用己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脫氫酶法測定空腹血糖。采用酶促法測定總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)濃度。
基因組學
根據製造商說明書(BioTeke Corporation, Beijing, China)，使用全血DNA提取試劑盒(AU18016)從空腹外周血白細胞中提取基因組DNA。使用NanoDrop 2000分光光度計(賽默飛世爾科學公司，沃爾瑟姆，馬薩諸塞州，美國)測量分離DNA的純度和濃度。所有snp均采用Sequenom Mass ARRAY平台(Sequenom, San Diego, California, USA)的高通量測序方法進行基因分型。本文總結了候選snp，采用了四種不同的方法:鹽敏感性高血壓致病途徑中候選基因的標記- snp;候選snp關聯研究的文獻檢索;鹽敏感性全基因組關聯研究結果從我們之前的研究結果中發現了36個miRNAs中的相關snp。在我們的下一階段研究中，我們將應用通用多因素降維方法0.9，使用Haploview V.4.0和遺傳風險評分，對snp進行聯合分析，並構建與環境風險因素相結合的預測模型，預測原發性高血壓和正常血壓個體的SSBP。
轉錄組
我們用TRI試劑(Invitrogen, Carlsbad, California, USA)、氯仿、異丙醇和75%乙醇從全血樣本中提取總RNA。然後將總RNA樣本反轉錄為cDNA，並使用Truseq DNA Sample Preparation Kit (Illumina, San Diego, California, USA)構建cDNA文庫用於下一代測序。使用Illumina Hiseq 2000係統(Illumina)對樣品進行測序。使用DEseq2和EdgeR檢測miRNA表達差異顯著。然後，我們使用以下四個標準篩選候選mirna:(1)差異表達比>2或<−2;(2)鹽敏性高血壓(SSH)或耐鹽性高血壓(SRH)表達水平超過5個拷貝;(3)通過文獻分析確定的與高血壓病理通路相關的miRNAs;(4)種子區有SNPs的miRNAs。
為了驗證RNA-Seq鑒定的候選mirna，采用SYBR Green PCR方法進行qRT-PCR (Geneskies, Shanghai, China)。以SnU6作為穩定的內源性對照。由擴增曲線確定閾值循環值(Ct值)。2−ΔCt采用相對定量表達法計算。SSH組和SRH組之間的差異表達水平通過獨立的雙樣本t檢驗進行分析。
後續
我們計劃每兩年通過電話和社區保健中心對所有參與者進行另外兩次隨訪。兩年一次的隨訪將包括基於訪談的問卷調查、血液、尿肌酐、腎小球濾過率(GFR)的實驗室測量和人體測量，以評估是否有任何心血管事件(基線時為高血壓)、腎功能改變或是否發生高血壓(基線時為血壓正常)。
統計方法
所有數據由兩名獨立研究人員使用EpiData V.3.1 (EpiData協會，歐登塞，丹麥)輸入，並在檢查兩份記錄的差異後建立數據庫。教育程度按六個類別分類:文盲、小學、初中、中學或高中、大學和本科、研究生及以上。這些類別被分為兩大類:高中以下學曆(文盲和小學)和高中及以上學曆。吸煙狀況和飲酒情況被分為兩類:有或沒有。家族史定義為父母中至少一人有高血壓或糖尿病史。
所有統計分析均采用SPSS V.19.0 for Windows軟件進行。連續變量的均值(±SD)或中位數(25%和75%百分位數)和分類變量的頻率被用來描述研究參與者的特征。的χ2分類變量采用Mann-Whitney U檢驗，連續變量采用Mann-Whitney U檢驗，評價高血壓人群與正常人群的差異。采用Cox比例風險模型和競爭風險模型分析鹽敏感性對心血管疾病的影響。缺失數據通過平均imputation方法進行處理。p值<0.05為有統計學意義。
質量控製
為確保程序的質量，向所有人員分發了一份社區工作手冊。在實地調查前，我們對全體工作人員進行了統一的技術培訓，內容包括本次研究的目的和意義、血壓測量方法、人體測量方法、電子表格問卷調查方法、血液和尿液樣本采集、儲存、運輸的特殊要求等。此外，所有參與血壓測量的人員都進行了額外的培訓，以確保血壓的準確性。
問卷調查采用電子設備進行，可以保證數據的完整性。非電子原始數據采用EpiData V.3.0軟件處理，由獨立工作人員雙重輸入。根據原始數據，對不符點數據進行了複核和修正。
患者和公眾參與
患者和公眾沒有參與研究問題、結果測量或研究設計的製定。這些患者也沒有參與研究的招募和執行。檢查結果首先被郵寄到保健中心，然後中心的工作人員打電話給病人，同時解釋結果並建議改變生活方式。
迄今為止的發現
參加者報名流程載於圖2．總體而言，來自兩個城市11個社區的2163名參與者被納入EpiSS，其中2144名(99.1%)參與者完成了問卷調查，而共有2120名(98.0%)參與者完成了MSAOSL-DST, 2083名(96.3%)參與者完成了24小時尿樣收集。共有2057名(95.1%)參與者(1061名高血壓患者，996名血壓正常患者)完成了所有調查步驟，並最終納入分析，其中排除了退出研究、未完成MSAOSL-DST或未提供空腹血液樣本的人。完成了95%以上的問卷調查、人體測量、血壓測量和生物醫學樣本收集。在入選的個體中，28.3%被歸類為SSBP。
參加者報名流程圖。鹽敏感性研究的係統流行病學;MSAOSL-DST，改良Sullivan急性口服鹽水負荷和利尿收縮試驗。
社會人口學特征、疾病流行率、與健康有關的生活方式因素、人體測量信息和實驗室測量的基線統計描述見表3．吸煙、受教育程度、飲酒、肥胖、高血壓家族史和糖尿病家族史分別有23人、99人、20人、4人、75人和78人的數據缺失。研究參與者主要是女性，中位年齡約為59歲。總的來說，51.6%的參與者是高血壓，與正常人群相比，高血壓參與者更有可能是吸煙者(17.0%是當前吸煙者)，有更高的BMI (26.84 kg/m)2高血壓25.15 kg/m2對於正常血壓)、超重、有高血壓和糖尿病家族史(均p<0.05)。對於血壓正常的個體，男性和女性的中位腰圍分別為89.00 cm和84.00 cm。高血壓患者男性為93.00 cm，女性為89.00 cm，顯著高於正常血壓組(p<0.001)。高血壓組的糖尿病和肥胖症患病率高於正常血壓組。
所有參與者的平均血清TC、TG、LDL和HDL均在正常範圍內。高血壓患者的平均空腹血糖和TG水平均略高，而正常組的TC和LDL水平略高。
在整個研究人群中，中位收縮壓為135.00 mm Hg，中位DBP為78.50 mm Hg。高血壓組收縮壓(142.00 mm Hg vs 126.50 mm Hg)、舒張壓(82.00 mm Hg vs 74.50 mm Hg)和平均血壓(102.00 mm Hg vs 91.75 mm Hg)值明顯高於正常血壓組(p<0.001)。
總共有2083名參與者提供了24小時的尿樣，2071名參與者(99.42%)提供了有效樣本。高血壓組的平均尿量、排鈉量、排鉀量均高於正常組。在整個研究人群中，總的估計鹽攝入量為8.01克/天。一般來說，高血壓患者的鹽攝入量中位數比正常組高約2.10 g/天(p<0.001)。女性參與者的鹽攝入量往往低於男性參與者(p<0.001)。
我們使用MSAOSL-DST來篩選鹽敏感性。共有2120名參與者完成了測試，其中583名參與者被歸類為鹽敏感型血壓。高血壓組鹽敏感性發生率無明顯高於正常血壓組(p>0.05)。
優勢和局限性
我們研究的優勢包括在整個研究方案中采用係統流行病學方法進行登記和質量控製。訓練有素的研究人員使用統一和標準化的數據收集和實驗室測試方法。因此，通過應用上述所有測量方法，可以降低檢測偏差。我們能夠分析鹽對血壓影響的綜合危險因素。EpiSS研究旨在納入高血壓患者，並同時將他們與健康參與者進行比較，以便結果足以得出進一步的結論。據我們所知，北京和遼寧地區尚無鹽敏感個體分布頻率的相關報道，而EpiSS是國內使用MSAOSL-DST最大的鹽敏感研究。我們下一階段的研究將基於相關的環境風險因素篩選基因位點和非編碼RNA。
我們的研究有一些局限性。受試者自願參與這項研究;我們沒有使用隨機抽樣的方法。此外，社區中老年婦女較多，因此我們的參與者不能代表一般人群。由於現場調查的條件，我們無法在基線中評估GFR和肌酐。我們將在後續的跟進中對這些指標進行評估。
協作
EpiSS的研究將繼續跟蹤和收集數據，以調查SSBP的潛在原因和心血管疾病的發病率。對合作感興趣的研究人員可根據EpiSS研究中提供的數據提出環境和遺傳研究建議，或提交額外數據收集請求。可以通過電子郵件向通訊作者(zlilyepi@ccmu.edu.cn)提交請求。
致謝
我們感謝所有參與者以及社區保健中心的全體工作人員和病人顧問。
參考文獻
腳注
患者發表同意書獲得的。
貢獻者總部和BL在北京和遼寧兩地設計並進行流行病學實地調查，開展人員培訓，在WHO臨床試驗平台注冊項目並撰寫稿件。HQ, BL, CG, ZL, HC, KL和WS進行了實地調查，收集並分析了數據。HQ, CG和KL修改了手稿。LZ獲得資助，監督整個研究過程，並修改手稿。所有作者都閱讀並批準了最終的手稿。
資金基金資助:國家自然科學基金(no. 1);國家重點研究與發展計劃項目(no. 81373076);2016YFC0900603)，北京市自然科學基金項目(批準號:2016YFC0900603);7172023)、北京市事業單位高層次人才引進與發展項目(批準號:7172023);CIT&TCD201504088)。
相互競爭的利益沒有宣布。
倫理批準EpiSS獲得了首都醫科大學倫理委員會的批準。2013 sy22)。
出處和同行評審不是委托;外部同行評審。
數據共享聲明在研究期間收集和/或分析的數據集可根據合理要求從通訊作者處獲得。我們歡迎有興趣獨立調查EpiSS研究具體問題的潛在合作者和研究人員。因此，我們希望得到合作者和研究人員的寶貴建議，以便從我們的隊列數據中獲得充分的價值。