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摘要
目標中性粒細胞炎症在阻塞性氣道疾病中的意義仍然存在爭議。最近的研究表明，在體循環中存在活躍的中性粒細胞群體，具有超節段形態，在炎症條件下具有高氧化爆發和功能可塑性。本研究的目的是在核形態學的基礎上，對阻塞性氣道疾病(哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和支氣管擴張)參與者和健康對照組的支氣管灌洗(BL)中中性粒細胞亞群進行表征，並評估中性粒細胞亞群與阻塞性氣道疾病參與者臨床參數之間的相關性。
設計橫斷麵探索性研究。
設置澳大利亞約翰亨特醫院和亨特醫學研究所。
參與者78名成人阻塞性氣道疾病患者包括穩定哮喘(n=39)、COPD (n=20)和支氣管擴張(n=19)患者和20名健康對照組。
材料與方法製備細胞旋，並根據核形態將中性粒細胞亞群分為超節段中性粒細胞(>4個葉)、正常中性粒細胞(2-4個葉)和帶狀中性粒細胞(1個葉)。
結果在所有參與者中鑒定出每個子集的中性粒細胞。與健康對照組相比，氣道疾病患者的超節段中性粒細胞數量升高(p<0.001)。COPD患者超節段中性粒細胞的數量和比例均最高(中位數(Q1-Q3)為1073.6 (258.8-2742)× 102/mL和24.5(14.0 ~ 46.5)%)。氣道疾病患者中高節段中性粒細胞比例的增加與用力呼氣量(1秒/用力肺氣量百分比)降低顯著相關(Spearman r=−0.322,p=0.004)。
結論中性粒細胞異質性在BL中很常見，在患有氣道疾病的成人中與更嚴重的氣流阻塞有關。需要進一步的工作來闡明超節段中性粒細胞在疾病發病機製中的功能後果。
- 免疫學
- 支氣管鏡檢查
- 慢性呼吸道疾病
這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名非商業(CC BY-NC 4.0)許可證發布，該許可證允許其他人以非商業方式分發、混音、改編、在此基礎上進行構建，並以不同的條款許可其衍生作品，前提是正確引用原始作品，給予適當的榮譽，任何更改都已注明，並且使用是非商業性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/．
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本研究的優勢和局限性
這是首次對阻塞性氣道疾病成人和健康對照組支氣管灌洗中三種形態不同的中性粒細胞亞群進行的探索性研究。
本研究探討了中性粒細胞亞群與氣道阻塞的臨床關係。
研究的橫斷麵性質限製了正確理解氣道中性粒細胞異質性背後的原因。
簡介
中性粒細胞是一種吞噬性先天免疫細胞，它在血管中巡邏，並在炎症觸發時被激活。1激活導致中性粒細胞遷移到感染部位，病原體可以通過吞噬作用或NETosis被消滅。2同樣，感染或損傷在病原體相關分子模式和損傷相關分子模式與氣道模式識別受體接合後可導致先天性免疫反應的啟動。這有助於釋放趨化刺激，如CXCL8，白細胞介素-1β和腫瘤壞死因子α (TNF-α)，導致中性粒細胞募集到氣道，3.這對緩解感染和炎症很重要。4相反，中性粒細胞不成比例或失調的流入或流出可導致持續性中性粒細胞性氣道炎症和組織損傷。5
以氣道中性粒細胞為特征的炎症在許多慢性阻塞性氣道疾病病例中都有報道。6其中包括20%-30%的哮喘病例，7超過40%的慢性阻塞性肺病(COPD)病例，8 970%為非囊性纖維化(CF)支氣管擴張。10目前哮喘和COPD的治療和管理策略側重於支氣管擴張以克服氣流限製，或吸入皮質類固醇(ICS)治療嗜酸性氣道炎症。11日12在非cf型支氣管擴張中，治療依賴於抗生素來控製疾病的感染性質。13雖然ICS在改善氣道嗜酸性粒細胞炎症方麵非常有效，14目前還沒有任何治療方法被證明可以影響中性粒細胞介導的炎症。這背後的一個主要原因是我們對中性粒細胞缺乏了解。15日16
盡管先前的研究表明氣道中性粒細胞升高與1秒內用力呼氣量(FEV)降低之間存在相關性1)在阻塞性呼吸道疾病中17我們對氣道中中性粒細胞數量的變化知之甚少。最近的研究已經確定了循環中性粒細胞的異質性。皮萊等18在炎症刺激後，在循環中發現三個中性粒細胞亞群(正常，帶狀和超節段)。每個亞群都有不同的核形態和表麵粘附分子表達模式，高節段中性粒細胞顯示出氧化爆發能力的增加以及抑製T淋巴細胞激活的獨特能力。在急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)患者的支氣管灌洗液(BL)和血液中都發現了相同形態上不同的亞群。19還有患有嚴重呼吸道感染的嬰兒。20.
阻塞性氣道疾病中中性粒細胞亞群的存在和特征尚不清楚。在這項探索性研究中，我們對患有哮喘、COPD、非cf性支氣管擴張和健康對照的成人BL液中的中性粒細胞亞群進行了表征和估計。此外，我們還探討了這些亞群與阻塞性氣道疾病患者臨床特征的關係。
材料與方法
患者和公眾參與
患者和/或公眾沒有參與本研究的研究問題和結果測量的製定。研究問題由作者(JLS和PABW)提出。如參與者部分所述，如果患者正在接受支氣管鏡檢查，則招募他們。研究成果將通過出版物和在當地、國家和國際研究會議上發表。
參與者
本研究從John Hunter醫院門診部招募了出於醫療目的正在接受支氣管鏡檢查或正在接受涉及氣管插管的外科手術並有肺功能測定結果的成年人。
研究設計
進行橫斷麵探索性研究，評估患者的臨床病史(包括呼吸道症狀、吸煙狀況和用藥情況)後采集BL樣本。肺活量測定和支氣管鏡檢查如下所示。
研究小組
研究對象為成人(>歲，年齡18歲)，既往6周無臨床胸部或上呼吸道感染史。健康的非吸煙者(n=20)經肺活量測定肺功能正常，無呼吸道疾病史。成人哮喘患者(n=39)經醫生診斷為哮喘，客觀證據顯示氣流變異性或支氣管刺激亢進。支氣管擴張(n=19)被定義為高分辨率CT掃描上氣道段永久性擴張的證據，而COPD患者(n=20)有呼吸道症狀並伴有支氣管擴張劑後FEV的證據1低於預測值的80%和/或支氣管擴張劑後FEV1/用力肺活量(FVC)低於70%。目前吸煙者被排除在外。由於這是一項全新環境下的探索性研究，因此每組參與者的人數都是根據之前在這一領域的探索性研究來確定的。18 19 21
肺量測定法
在John Hunter醫院進行肺活量測定(Easy One Spirometer, ndd Medical Technologies, Massachusetts, USA)。可變梗阻定義為支氣管擴張劑後FEV改變1400 mcg沙丁胺醇後降低12%或200 mL，支氣管高反應性定義為FEV下降至少15%1用4.5%生理鹽水誘導支氣管刺激後。
支氣管鏡檢查
在John Hunter醫院行柔性支氣管鏡檢查，將支氣管鏡插入右側中間肺葉，用40 mL無菌生理鹽水清洗支氣管。一部分BL被送去進行微生物檢測，其餘的則按照如下所述進行處理。
提單處理
在Hunter醫學研究所收集後1小時內，用台盼藍排除法過濾BL，評估總細胞計數(TCC)和活力。將BL離心，將細胞顆粒重懸於磷酸鹽緩衝鹽水中至1×10濃度6/mL，製備細胞旋粒。細胞旋用May-Grünwald Giemsa (Beckman Coulter, Brea, CA, USA)染色，並進行400個非鱗狀細胞的差異細胞計數。
中性粒細胞亞型評估
在油浸泡下檢查染色的細胞旋，並將100個中性粒細胞分為條帶中性粒細胞、正常中性粒細胞和超節段中性粒細胞。帶狀中性粒細胞呈單條帶狀葉，無明顯分裂;正常的中性粒細胞有2 ~ 4個葉，每個葉都有清晰可見的外邊界;超節段中性粒細胞有四個以上的葉，每個葉都有一個適當可見的外部邊界，如圖所示圖1．
中性粒細胞的子集，以其細胞核中葉的數量為特征。(A)阻塞性氣道疾病患者支氣管灌洗(BL)細胞旋的代表性圖像顯微圖(×100原始放大，May-Grünwald Giemsa (MGG)染色)由(B)帶狀中性粒細胞，(C)正常中性粒細胞和(D)超節段中性粒細胞組成。
統計分析
數據分析使用Stata軟件V.11 (StataCorp, College Station, TX, USA)。除非另有說明，結果報告為平均值(SD)或中位數(IQR)。采用雙樣本Wilcoxon 's秩和檢驗或t檢驗和Kruskal-Wallis檢驗或單因素方差分析對連續測量進行分析。使用Fisher精確檢驗對分類數據進行分析。計算中性粒細胞亞群與臨床特征之間的Spearman相關係數。
結果
臨床特點
COPD患者更有可能是有更嚴重氣流阻塞的戒煙男性(表1)．與哮喘組相比，COPD患者服用ICS的人數較少，然而，COPD患者的ICS平均每日劑量顯著高於哮喘組。患有嚴重哮喘的人數高於患有嚴重COPD的人數(表1根據全球哮喘倡議22以及全球慢性阻塞性肺病倡議23分別進行嚴重分級。根據支氣管擴張的嚴重程度指數，參與者的嚴重程度一般為輕度24（表1)．支氣管擴張的原因主要是特發性和感染後補充表S1)．
炎症細胞計數
參與者的BL炎症細胞計數詳細見表2．患有支氣管擴張和COPD的參與者TCC增加(表2)．支氣管擴張組和COPD組中性粒細胞比例和數量明顯高於健康對照組，而哮喘組中性粒細胞比例明顯低於COPD組。與支氣管擴張和COPD相比，哮喘組的中性粒細胞數量也顯著降低。慢性阻塞性肺病和哮喘患者嗜酸性粒細胞的比例明顯高於健康對照組，而三種阻塞性氣道疾病患者嗜酸性粒細胞的數量均明顯高於健康對照組。
中性粒細胞的子集
所有參與者的BL中均鑒定出三種中性粒細胞亞群。與健康組和哮喘組相比，支氣管擴張組和COPD組正常中性粒細胞數量顯著增加(圖2一個)．與健康組和哮喘組相比，支氣管擴張組的帶狀中性粒細胞數量最高，而COPD組的帶狀中性粒細胞數量僅高於健康組(圖2 b)．與健康對照組相比，所有阻塞性氣道疾病組的高節段中性粒細胞數量顯著增加，與哮喘和支氣管擴張患者相比，COPD患者的高節段中性粒細胞數量增加(圖2 c)．
支氣管擴張、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘和健康對照組支氣管灌洗(BL)中中性粒細胞亞群數量(A-C)和中性粒細胞亞群比例(D-F)每組點圖中的線表示中位數。^與健康對照組相比P<0.0125;*與哮喘比較P<0.0125;與COPD相比，根據Kruskal-Wallis檢驗，#P<0.0125。
當考慮中性粒細胞亞群的相對分布比例(見圖2 d-f)， COPD患者正常中性粒細胞和帶狀中性粒細胞的比例顯著降低，隨後超節段中性粒細胞的比例顯著增加。
阻塞性氣道疾病中性粒細胞亞群與臨床特征的關係
超節段中性粒細胞比例與兩種FEV呈顯著負相關1%預測(Spearman的r=−0.301,p=0.007)和FEV1/FVC% (r=−0.322,p=0.004，圖3)在患有阻塞性氣道疾病的參與者中(n=78)。而帶狀中性粒細胞(FEV1%預測(r=0.181, p=0.114)， FEV1/FVC% (r=0.213, p=0.061))和正常中性粒細胞(FEV1%預測(r=0.189, p=0.097)， FEV1/FVC% (r=0.213, p=0.062)。超節段中性粒細胞總數之間無相關性(×102細胞/mL)與兩FEV1%預測(r=−0.152,p=0.185)和FEV1/FVC% (r=−0.173,p=0.131)。同樣，中性粒細胞總比例和數量與兩種FEV均無相關性1(r=−0.143,p=0.212和r=−0.036,p=0.758)1/ FVC % (r =−0.142,p = 0.214和r =−0.043,p = 0.707)。
超分段中性粒細胞比例與FEV的散點圖1%預測(A)和FEV1/FVC (B)在支氣管灌洗(BL)的阻塞性氣道疾病參與者。慢性阻塞性肺病;FEV1，用力呼氣量在1 s內;FVC，強迫肺活量。
COPD患者中，超節段中性粒細胞比例與嗜酸性粒細胞比例呈正相關(r=0.535, p=0.015) (圖4一)，與細胞活力呈負相關(r=−0.697,p<0.001) (圖4 b)．在任何其他臨床組或總體人群中未觀察到這種關聯(數據未顯示)。
(A)超節段中性粒細胞比例與嗜酸性粒細胞比例的散點圖，(B)慢性阻塞性肺疾病(COPD)參與者支氣管灌洗(BL)中總細胞的活力。
為了進一步探討嗜酸性粒細胞和高分葉中性粒細胞比例之間的相關性，我們決定根據嗜酸性粒細胞性COPD (E-COPD)(≥3%嗜酸性粒細胞)和非嗜酸性粒細胞性COPD (NE-COPD)(<3%嗜酸性粒細胞)的炎症亞型對COPD參與者進行檢查。
E-COPD和NE-COPD
12名參與者以E-COPD為特征，8名參與者以NE-COPD為特征。NE-COPD組TCC顯著升高(NE-COPD, 1.71 (1.47) ×106/毫升;E-copd, 0.67 (0.55) ×106/mL, p=0.037)和細胞活力(NE-COPD, 90.82 (5.80)%;E-COPD, 76.67 (14.64)%， p=0.019)，中性粒細胞比例顯著升高(NE-COPD, 85.50 (77.00-92.38)%;E-COPD, 75.75 (69.88-77.75)%， p=0.037)和中性粒細胞數(NE-COPD, 148.37 (132.16) ×104/毫升;E-copd, 50.93 (42.95) ×104/mL, p=0.028)。E-COPD中嗜酸性粒細胞的數量和比例明顯增高，即(NE-COPD, 1.14 (1.05) ×104/毫升;E-copd, 4.71 (4.09) ×104/mL, p=0.040)和(NE-COPD, 1.09 (0.57)%;E-COPD, 9.08 (5.50)%， p<0.001)。除此之外，兩組間其他臨床參數均無顯著差異。
討論
該研究在慢性阻塞性氣道疾病參與者和健康對照組的BL中確定了三種形態上不同的中性粒細胞亞群，即帶狀、正常和超節段性。阻塞性氣道疾病患者的超節段中性粒細胞數量明顯高於健康對照組。超節段中性粒細胞的比例與較低的FEV相關1更嚴重的氣流阻塞(FEV1/FVC%)在阻塞性氣道疾病患者和COPD患者中存在嗜酸性氣道炎症。
中性粒細胞種群形態異質性的概念是最近才出現的。25我們檢查了阻塞性氣道疾病參與者和健康對照組BL中的中性粒細胞異質性。中性粒細胞異質性的原因尚不清楚，但可能是由於在向組織過渡之前骨髓中細胞成熟的不同階段，或者中性粒細胞可能在炎症過程中改變其形態，以適應炎症氣道中的應激源。5 26
帶狀中性粒細胞也被稱為不成熟中性粒細胞，據報道，膿毒症患者的體循環中顯示其抗菌免疫功能不全。27急性炎症期間過度需求導致骨髓中成熟中性粒細胞耗竭，氣道內帶狀中性粒細胞出現。20.
呼吸道中超節段中性粒細胞的存在可能是炎症的一個特征，因為超節段中性粒細胞在其他炎症情況(如創傷)中也有報道18以及慢性炎症性肺病，如急性呼吸窘迫綜合征。19
中性粒細胞的超節段形態表明與帶狀和正常中性粒細胞相比成熟程度增加。18成熟被認為發生在發炎的氣道中，因為存在由促生存介質組成的富含細胞因子的環境。28超節段中性粒細胞形成的機製已知與中性粒細胞的生命周期有關。存活率的增加導致中性粒細胞的細胞核出現更多的壓痕和切分，因此超節段性中性粒細胞也被稱為“老中性粒細胞”。29
最近，當健康誌願者血液中的中性粒細胞與一名ARDS患者的支氣管肺泡灌洗液一起孵育時，顯示了富含化學吸引劑的環境改變中性粒細胞表型的能力。這些中性粒細胞改變了它們的表型，具有超節段形態的中性粒細胞增加。19在阻塞性氣道疾病患者的氣道中可能也發生了類似的慢性過程，他們通常具有較高水平的促炎細胞因子和炎症介質。先前的研究表明，循環中的超節段中性粒細胞表現出低表達的l -選擇素，這可能會降低其在內皮細胞上的錨定能力，從而減少其進入炎症氣道的機會。30.因此，我們在研究中觀察到的超節段中性粒細胞可能不是直接來自循環，而是在促生存介質的影響下在氣道中成為超節段中性粒細胞。
促進中性粒細胞存活並可存在於氣道中的介質包括:粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，趨化因子如CXCL-8和脂質介質如血清澱粉樣蛋白A。2 26已知GM-CSF和CXCL-8通過促進抗凋亡蛋白(如生存素)的表達和防止TNF-α介導的凋亡來增強中性粒細胞的生存。31日32而已知血清澱粉樣蛋白A通過防止線粒體損傷和降低caspase-3(凋亡蛋白)活性來延長中性粒細胞壽命。33我們過去的研究報道了中性粒細胞性哮喘、支氣管擴張患者痰標本中CXCL-8水平升高34和慢性阻塞性肺病。35除此之外，我們還報道了COPD患者血清澱粉樣蛋白A水平升高與氣道中性粒細胞性炎症相關，這對皮質類固醇是難治的。36這表明，這些標記物的升高可能在增強氣道中中性粒細胞的存活和促進超節段中性粒細胞的存在方麵發揮了一定的作用。
在本研究中，我們也報道了COPD患者嗜酸性粒細胞與超節段中性粒細胞比例呈正相關，且E-COPD患者超節段中性粒細胞比例升高。氣道中嗜酸性粒細胞的存在可以進一步提高GM-CSF的水平，因為它們自己產生了這種細胞因子，37可以進一步促進中性粒細胞的成熟。除此之外，使用ICS控製嗜酸性粒細胞炎症可能通過增加抗凋亡蛋白如Mcl-1(誘導髓係白血病細胞分化蛋白)和中性粒細胞凋亡抑製蛋白的活性來增強炎症氣道中中性粒細胞的生存。38這種成熟程度的提高和死亡的預防可能導致超節段中性粒細胞比例的增加。
關於所有超節段中性粒細胞是否具有相同的功能特征也存在爭議。皮萊等18在體外共培養中觀察到誘導急性全身炎症後獲得的高節段中性粒細胞對T淋巴細胞具有免疫抑製作用。在另一項研究中，Whitmore等39觀察到中性粒細胞在孵育後轉變為高分節型幽門螺杆菌，然後對胃上皮細胞表現出細胞毒活性。但有趣的是，在這兩項研究中，超節段中性粒細胞通過相同的機製表現出各自的反應，即在各自的細胞中給予大量的活性氧(ROS)，並且在它們的表麵也具有相似的粘附分子表達模式。
超節段中性粒細胞比例與FEV顯著相關1在我們的研究中，嚴重的氣流阻塞表明，在高節段中性粒細胞常見的地方，氣道阻塞最嚴重。這可能是以往研究中觀察到的超節段中性粒細胞產生高氧化爆發的結果，在這些研究中，超節段中性粒細胞在體外刺激後表現出高氧化爆發。18 19中性粒細胞產生的高氧化爆發也可能損害它們從氣道的及時清除40並引發中性粒細胞流入氣道的惡性循環。6氣道內中性粒細胞清除障礙可引起中性粒細胞壞死，其細胞毒性如活性氧(ROS)和中性粒細胞彈性蛋白酶(elastase)等蛋白水解酶溢出氣道腔內。41這可進一步損害氣道壁，促進粘液分泌過多，導致FEV明顯下降1如早先報道的COPD。42有趣的是，我們沒有觀察到這種相關性與其他中性粒細胞亞群或總中性粒細胞比例或數量。需要進一步的研究來了解高節段中性粒細胞是否由於更嚴重的疾病而普遍存在，或者相反，它們是否影響疾病的嚴重程度。
研究的橫斷麵性質限製了正確建立氣道中性粒細胞異質性關係的因果關係。此外，樣本量小是本研究的另一個局限性。因此，需要進一步的大樣本量的驗證性研究來驗證本研究的發現。此外，還需要對病原體、促生存介質和當前藥物(如ICS)對中性粒細胞亞群形態、表麵表達和功能行為的影響進行詳細的體外研究，以更好地了解氣道中超分段中性粒細胞的形成，並隨後製定更全麵的氣道中性粒細胞評估和管理策略。
結論
我們已經發現在健康和阻塞性氣道疾病參與者的氣道中存在三種形態不同的中性粒細胞亞群，即哮喘、COPD和支氣管擴張。阻塞性氣道疾病患者氣道中高節段中性粒細胞比例的增加與這些患者肺功能的降低有關。與所有其他組相比，COPD參與者中超節段中性粒細胞的比例最高。
致謝
我們感謝來自Andrew Reid, Michelle Gleeson, Kellie Fakes和Bridgette Donati的技術支持，以及來自健康肺部優先研究中心的Lorissa Hopkins和Douglas Dorahy的臨床支持。
參考文獻
腳注
患者發表同意書不是必需的。
貢獻者JLS提出了這個想法並設計了這項研究。JLS還在整個研究過程中監督和協調。RL進行了子型計數並撰寫了手稿，JLS、PABW、KJB和DB對手稿進行了進一步的完善和編輯。PABW進行支氣管鏡檢查，KJB監督支氣管灌洗處理和細胞旋液製備，DB監督統計分析。
資金作者沒有從任何公共、商業或非營利部門的資助機構宣布對這項研究的具體資助。
相互競爭的利益沒有宣布。
倫理批準該研究得到了亨特新英格蘭人類研究倫理委員會的批準(文獻號:05/08/10/3.09)。
出處和同行評審不是委托;外部同行評審。
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