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遺傳學和基因組學
協議
人類疼痛敏感性的遺傳成分:健康誌願者實驗疼痛全基因組關聯研究的協議
  1. Annina B Schmid1，
  2. Kaustubh Adhikari2，3.，4，
  3. Luis Miguel Ramirez-Aristeguieta5，
  4. juan camilo Chacon-Duque2，6，
  5. 喬凡尼Poletti7，
  6. 卡拉加洛7，
  7. 舊金山Rothhammer8，
  8. 加布裏埃爾Bedoya9，
  9. Andres Ruiz-Linares10，11，
  10. 大衛·L·貝內特1
  1. 1納菲爾德臨床神經科學係，牛津大學，牛津大學、英國
  2. 2遺傳、進化與環境學係，倫敦大學學院，倫敦、英國
  3. 3.細胞與發育生物學學係，倫敦大學學院，倫敦、英國
  4. 4數學與統計學院，科學、技術、工程與數學學院，開放大學，米爾頓凱恩斯、英國
  5. 5QST實驗室。牙科學院，安蒂奧基亞大學，麥德林、哥倫比亞
  6. 6地球科學係，自然曆史博物館，倫敦、英國
  7. 7神經生物學與分子遺傳學聯合，Investigación Desarrollo實驗室，Filosofía科學學院，秘魯大學卡耶塔諾埃雷迪亞，秘魯首都利馬、秘魯
  8. 8阿爾塔研究所Investigación，塔拉帕acac大學，阿裏卡、智利
  9. 9GENMOL (gen宇航分子)，安蒂奧基亞大學，麥德林、哥倫比亞
  10. 10當代人類學教育部重點實驗室，遺傳與發育協同創新中心，生命科學學院，人類表型研究所，複旦大學，上海，上海,中國
  11. 11Cnrs, efs, ades，法國的大學，馬賽、法國
  1. 對應到David L Bennett教授;david.bennett在{}ndcn.ox.ac.uk

摘要

介紹疼痛是全球疾病負擔的一個主要組成部分。最近的研究表明，基因對疼痛的易感性和嚴重程度有很大的影響。盡管大多數現有證據依賴於候選基因關聯或連鎖研究，但使用全基因組關聯研究(GWAS)對疼痛敏感性的遺傳基礎的研究仍處於起步階段。本方案描述了在拉丁美洲混血無血緣關係的健康個體樣本中，對基線疼痛敏感性和傷害性敏感的遺傳貢獻的擬議GWAS。

方法與分析將在無血緣關係的健康混合血統個體中進行一項關於naïve狀態下疼痛敏感性的遺傳貢獻的GWAS和隨後的傷害性敏感。機械和熱痛敏感性將通過評估疼痛閾值的一係列定量感官測試進行評估。此外，將評估局部應用芥菜油對皮膚的機械和熱致敏變化。

道德與傳播本研究獲得了倫敦大學學院研究倫理委員會(3352/001)和安蒂奧基亞大學牙科學學院生物倫理委員會(CONCEPTO 01-2013)的倫理批準。研究結果將通過論文和在國際會議上的演講傳播給委員、臨床醫生和服務使用者。

  • 遺傳學
  • 疼痛
  • 傷害感受
  • 疼痛的敏感性
  • 痛覺過敏
  • 全基因組關聯研究

這是一篇根據知識共享署名4.0 (CC BY 4.0)許可發布的開放獲取文章，該許可允許其他人出於任何目的複製、再發布、再混合、轉換和構建此作品，前提是正確引用原始作品，提供許可鏈接，並指出是否進行了更改。看到的:https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。

http://dx.doi.org/10.1136/bmjopen-2018-025530

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    本研究的優勢和局限性

    • 我們建議對基線疼痛敏感性和傷害性致敏進行全基因組關聯研究。

    • 這項研究將在哥倫比亞的一個混合人群中進行，其中有不同比例的歐洲人、美洲原住民和撒哈拉以南非洲人的血統。

    • 表型數據將由一名訓練有素的審查員收集，從而產生高質量的測量。

    • 由於我們專注於在單個中心獲得的高度可重複的疼痛表型，因此我們的初始樣本量僅限於1500-2000名參與者。這將使我們能夠僅識別具有中等和大(但不是小)效應大小的遺傳變異。

    介紹

    疼痛是全球疾病負擔的一個主要組成部分，腰背部和頸部疼痛是多年殘疾的唯一主要原因，緊隨其後的是偏頭痛和其他肌肉骨骼疾病。1疼痛是一種多維度的體驗，涉及物理、生化、生理、認知、情感、行為和社會文化因素的高度複雜的相互作用。許多研究已經確定了一係列慢性疼痛的遺傳因素。2重要的是，越來越多的患者群體研究表明，遺傳是疼痛易感性和嚴重程度的重要因素。2 - 4值得注意的是，使用臨床疼痛結果或實驗疼痛模型的雙胞胎研究表明，對疼痛的敏感性具有高達55%的遺傳性。5 - 10有趣的是，遺傳性根據臨床疼痛結果或在實驗疼痛模型中測試的感覺模式而有很大差異。7有證據表明，不同的感覺模式可能有不同的遺傳成分，導致人類的差異，10這與動物模型一致，強調了不同的神經生物學介導不同的感覺模式。11

    全基因組關聯研究(GWAS)是鑒定人類複雜表型遺傳決定因素的一項強大技術。然而，GWAS對疼痛的分析仍然有限，主要是由於需要大量的個體來獲得足夠的能量，以及準確表型特征的複雜性，最終代表了個人的主觀感知。2與疼痛變化可能受疾病過程或治療嚴重程度影響的疾病隊列相比，測量基線疼痛敏感性的實驗性疼痛研究具有在標準條件下研究一種刺激(例如，控製強度、位置和刺激持續時間)的優勢。迄今為止，已經進行了幾項候選基因研究，以確定遺傳對人類疼痛敏感性的影響，5-9 12 13然而，據我們所知，尚未有完整的GWAS報告。一項全基因組研究評估了單核苷酸多態性(SNPs)的相關性，該相關性是由外顯子組測序在一組雙胞胎中發現的，這些雙胞胎被確定為具有特別高或低的熱痛敏感性。通過通路分析，血管緊張素通路的基因變異顯著富集。14然而，實驗疼痛敏感性和臨床疼痛嚴重程度之間往往不存在直接聯係，15有證據表明，實驗疼痛模型的結果可以預測臨床相關的病理性疼痛，如術後疼痛。16不管實驗性疼痛和病理性疼痛之間的關係如何，了解對實驗性疼痛敏感性的遺傳影響將為疼痛敏感性的潛在機製提供重要的生物學見解。

    到目前為止，大多數疼痛領域的遺傳研究的一個重要缺點是，它們主要是在歐洲血統的人群中進行的，因此，它們隻探索了人類表型和遺傳多樣性的一小部分。17 18這在疼痛研究中很重要，因為最近的研究指出，歐洲裔美國人、非洲裔美國人和拉丁裔美國人的疼痛閾值是不同的。月19 - 21日然而，這種疼痛閾值的變化是否與神經生物學機製或其他因素(如社會或文化)的差異有關尚不清楚22參數。此外，最近的研究表明，由於時間累積，與傷害感覺係統增敏相關的表型可能使人們容易發生臨床相關的疼痛。23然而，大多數研究關注的是naïve狀態下的疼痛表型，而不是敏感狀態;隻有少數研究調查了傷害性致敏的遺傳成分。7日24因此，我們打算使用一種醛原(異硫氰酸烯丙酯[AITC]，一種配體門控離子通道TRPA1的激動劑)來使傷害感覺係統敏感，以複製病理性疼痛狀態下可能發生的變化。

    該方案提出了一個基因對歐洲/美洲原住民/非洲混血無血緣關係的健康個體的基線疼痛敏感性和傷害性敏化的貢獻的GWAS。我們將評估基線皮膚疼痛閾值以及芥末油(AITC)應用後致敏的變化，這是一個組織損傷的受控模型。我們假設我們將在naïve和敏感狀態下識別與實驗性疼痛刺激相關的snp。闡明疼痛變異的遺傳基礎有可能揭示未來鎮痛藥發展的目標。這可以轉化為改善疼痛管理，可能針對個人的疼痛風險或恢複能力，包括不同人群之間的敏感性差異。

    方法與分析

    本GWAS遵循《加強遺傳關聯研究報告指南》。25研究過程的流程圖詳見圖1。

    Study procedure. The graph details the study procedure from recruitment to data analysis. Yellow boxes represent new procedures; green boxes indicate data generation and collection; blue boxes indicate a procedural step.  AITC, allyl isothiocyanate; BMI, body mass index; CANDELA, Consortium for the Analysis of the Diversity and Evolution of Latin America; CDT, cold detection thresholds; GWAS, genome-wide association study; HPT, heat pain threshold; MPT, mechanical pain threshold; PCs, principal components; PPT, pressure pain threshold; QST, quantitative sensory testing; TSL, thermal sensory limen; VDT, vibration detection threshold; VAS, Visual Analogue Scale; WDT,  warm detection thresholds; WUR, wind-up ratio.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">圖1
    圖1

    研究過程。該圖詳細說明了從招募到數據分析的研究過程。黃框代表新的程序;綠色方框表示數據生成和收集;藍框表示程序步驟。AITC，異硫氰酸烯丙酯;BMI，身體質量指數;拉丁美洲多樣性和演變分析協會;CDT，冷檢測閾值;GWAS，全基因組關聯研究; HPT, heat pain threshold; MPT, mechanical pain threshold; PCs, principal components; PPT, pressure pain threshold; QST, quantitative sensory testing; TSL, thermal sensory limen; VDT, vibration detection threshold; VAS, Visual Analogue Scale; WDT, warm detection thresholds; WUR, wind-up ratio.

    參與者

    將在哥倫比亞麥德林通過當地大學的公共布告板、散發傳單和通過當地印刷媒體招募18-40歲的健康參與者。此外，我們還邀請拉丁美洲多樣性和演變分析聯合會(CANDELA)以前的與會者26GWAS希望參與這個項目。

    招募健康的年輕參與者在GWAS研究中具有優勢。他們不太可能患有未被發現的疾病或其他可能影響其疼痛敏感性生物途徑的問題。年輕人也將減少可能影響其疼痛敏感性的環境(外部)因素的總體累積暴露或風險。這些因素增加了參與者疼痛感知反應的整體可變性，降低了檢測遺傳原因的能力。由於大多數性狀受到遺傳和環境因素的共同影響，包括CANDELA在內的許多研究傾向於使用年輕參與者來發現遺傳變異。27

    如果參與者患有慢性疼痛或任何慢性疾病(如糖尿病、神經退行性疾病、肌肉骨骼疾病或精神疾病)，他們將被排除在外。目前正在服用鎮痛藥、抗炎藥、阿片類藥物、抗組胺藥、抗抑鬱藥或抗癲癇藥的參與者將被排除在外。懷孕或處於經期(自我報告)的婦女將被排除在研究之外。建議參與者在測試前1小時內不要吸煙或喝咖啡，並在測試前8小時內避免使用精神活性物質或酒精。進一步的排除標準包括當前或過去自己造成的傷害，以及影響手臂的皮膚、創傷或感染性疾病，以及對任何藥物、材料、食物或昆蟲叮咬有嚴重過敏反應的曆史。中度至重度焦慮的參與者(漢密爾頓焦慮量表≥25分)28)或重度抑鬱症(QIDS-SR16項抑鬱症狀自我報告快速量表)29將被排除在研究之外。招聘於2013年1月開始，預計大約需要5-7年的時間。

    過程

    參與者將在Antioquia大學的定量感官測試(QST)實驗室(Medellín)參加一次預約。在知情同意之後，年齡和自我報告的性別將被記錄下來，參與者將回答有關他們自我報告的祖先的問題(見在線補充附錄1)。測量身高和體重，計算身體質量指數(BMI)。由於焦慮等心理因素會影響實驗性疼痛測試中的疼痛感知，30.參與者將完成西班牙語版漢密爾頓焦慮評定量表和QIDS-SR16。與其他抑鬱評分相比，QIDS-SR16具有可接受的內部一致性和中至強的並發效度31其西班牙語版本具有足夠的重測信度和較高的內部一致性。32漢密爾頓焦慮評定量表具有較高的評定者間信度和重測信度33良好的構念效度。34

    naïve狀態下感覺功能的評估

    我們將確定naïve狀態下的感覺功能，並遵循傷害敏感化。基線感覺功能將使用特定的靜態和動態QST進行評估。這些包括冷檢測閾值和熱檢測閾值，熱感覺閾值和熱痛閾值(HPT)，使用ThermoTester (Q-sense, Medoc, Israel, 30×30 mm熱模尺寸)。熱閾值的記錄將嚴格遵循已公布的QST指南。35機械性疼痛閾值(MPT)將使用20件套von Frey頭發(Touch Test, North Coast, USA)進行評估，施加不同的力(9.8、13.7、19.6、39.2、58.8、78.5、98.1、147.1、255.0、588.4、980.7、1765.2、2942.0 mN)。von Frey毛發將從9.8mN的基線刺激開始，以2秒開，2秒關的順序遞增，直到參與者第一次感覺到刺激是尖銳的(刺痛)。隨後，毛發將按降序排列，直到刺激被認為是鈍的。五組上升和下降刺激的幾何平均值被定義為MPT。上弦比將通過視覺模擬量表(VAS 0-100)上的單個刺激的數值疼痛等級來確定，然後是在相同的1厘米內以1hz施加的10組刺激的平均疼痛等級2用255mn的von Frey頭發。這將重複五次，比率將建立為刺激序列的平均評級除以單個刺激的平均評級。振動檢測閾值(VDT)將通過用Rydel-Seiffer音叉記錄3個消失閾值的平均值來確定。壓痛閾值(PPT)將用手動算法(Wagner Instruments, Greenwich, Connecticut, USA)記錄一式三份，其平均值用於分析。

    被測試的一側將被隨機分配，患者將首先熟悉對照側前臂的感覺測試，然後在測試臂上進行實際測量。除VDT(尺骨莖突)和PPT(魚際肌肉)外，所有測試均在前臂掌側的一半進行。

    芥菜油引起傷害性致敏

    在基線感官測量後，將使用醋酸酯模板在前臂掌側標記一個帶有八個輻條的星形，每個輻條包含八個點，以1厘米的增量(圖2)。在開始之前，將32°C的恒溫器放置在恒星中心5分鍾，使皮膚溫度標準化。然後，我們將像之前一樣使用芥末油(AITC (Sigma)，在橄欖油中稀釋30%)應用致敏範例。36AITC是芥菜油的活性成分，可以激活離子通道TRPA1，引起皮膚光斑和傷害性致敏。37一個小棉簽浸泡在芥末油將適用於0.64厘米2前臂掌側區域，用Tegaderm (3M)固定10分鍾。36在此期間，每隔30秒使用電子VAS記錄疼痛評分，評分範圍從0到100。10分鍾後，將芥菜油去除，並記錄皮膚光斑的麵積，每片最接近0.5厘米。7八個三角形將通過連接相鄰輻條上的點來創建，總麵積將通過添加所有三角形段來計算。使用芥菜油的麵積將從總麵積中減去，以確定二次火炬的麵積(火炬麵積)。

    Method to determine area of flare, punctuate hyperalgesia and allodynia. (A) An acetate template is used to mark a star with eight spokes containing eight points at 1 cm increments on the volar forearm. (B) A small cotton swab soaked in 30% mustard oil is applied in the center of the star and (C) held in place with a Tegaderm for 10 min. During this time, pain scores are recorded every 30 s. (D and E) After removal of the mustard oil, the skin flare will be marked and the area calculated. (F) The area of brush-evoked and punctuate hypersensitivity will be determined with a brush and a 98.1 mN von Frey hair respectively (pictured) by testing potential hypersensitivity at each point on the eight spokes.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">圖2
    圖2

    方法:測定耀斑、刺痛覺和異位性痛覺的麵積。(A)用醋酸酯模板在前臂掌側標記一個有八個輻條的星形，其中包含八個點，增量為1cm。(B)用小棉簽蘸30%芥末油塗抹在星星的中心，(C)用Tegaderm固定10分鍾。在此期間，每30秒記錄一次疼痛評分。(D和E)去除芥菜油後，將標記皮膚耀斑並計算麵積。(F)通過對8條輻條上每個點的潛在超敏反應進行測試，分別用刷子和98.1 mN von Frey頭發(如圖)確定刷子誘發超敏反應和標點超敏反應的麵積。

    在繪製耀斑後，將用刷子(瑞典Somedic Senselab Nr 5)在八個輻條上的每個點上塗抹1厘米長的筆畫，從外部開始，向敏感中心移動，以確定刷子誘發超敏反應的區域。用98.1 mN燈絲(Bailey Instruments, UK)按照相同的程序測定間斷超敏區域。36至於耀斑，芥末油應用的主要區域將從兩個過敏區域中減去，這樣記錄的區域代表繼發性痛覺過敏/過敏。

    在芥末油致敏後，MPT和HPT將使用上述相同的方法重複。所有後敏化試驗將在去除芥菜油後5分鍾內進行。

    naïve和敏感感覺功能協議的可靠性

    為了確定測試者內部的信度，我們在2-6周內的兩個不同場合對n=12名健康誌願者重複了由同一研究者執行的感覺功能方案。類內相關係數(3.1)顯示所有感官測試變量(表1)。38

    查看該表:
    表1

    感覺功能協議的內部可靠性

    基因分型

    每位參與者將捐獻血液或唾液(Oragene OG-500, Genotek, Canada)用於DNA提取。DNA樣本將在含有約70萬個標記的Illumina HumanOmniExpress芯片上進行基因分型。在已經參加過坎德拉GWAS的誌願者中，39來自同一芯片上基因分型的血液樣本的基因型數據已經可用，並將被重複使用。

    來自Illumina陣列的全基因組基因型數據將進行質量控製40排除任何未達到嚴格閾值的標記或樣品。Illumina GenomeStudio軟件中基因型調用算法提供的質量指標;41如GenTrain評分、聚類分離評分和過量雜合率將用於過濾基因型差的snp。隨後的snp水平和樣品水平的質量控製閾值，如缺失將被應用。檢查X染色體和Y染色體的記錄和基因數據的性別不匹配。隻有通過所有標準的樣品和snp將被保留用於分析。目前使用的CANDELA基因型樣品的質量控製方案的詳細信息可在網上提供補充附錄2。

    統計分析

    樣本量計算

    根據Visscher中描述的公式估計不同樣本和效應大小的實驗性疼痛表型的GWAS功率等。42從現有的實驗性疼痛研究中獲得的實驗性疼痛表型的一係列效應大小顯示了估計的功率。統計軟件R V.3.4.143是用來進行計算和生成數字的。守則公布於https://github.com/kaustubhad/gwas-power。

    在基於全基因組SNP的GWAS研究中，關聯分析通常使用多元線性回歸模型進行，其中性狀值回歸到SNP基因型(加性編碼)和其他協變量，這些協變量通常包括年齡、性別、BMI和遺傳主成分(PCs)。p值閾值39 42對於全基因組的顯著關聯通常是5×10−8而暗示性顯著關聯的閾值通常是10−5。計算全基因組顯著性閾值和暗示性顯著性閾值的GWAS功率的公式在網上給出補充附錄3，當前GWAS設置計算的功率見圖3。

    Estimated power (in percentage) under the standard genome-wide association studies (GWAS) settings of using whole-genome genotyping data. (A) Estimated power (in percentage) as a heatmap, setting the significance threshold at 5×10−8, the commonly used threshold for genome-wide significance in GWAS studies. (B) Estimated power with the significance threshold set at 10−5, the commonly used threshold for suggestive significance. In panels A-B, the x-axis denotes a range of sample sizes (n) in a GWAS, the y-axis represents the proportion of trait variance (q2) explained by a marker. Power of detecting the marker at a specific (n, q2) combination is represented by a colour gradient. Contour lines for power at 10% intervals are also shown. Panels C-D shows power curves for the expected sample sizes for this study. (C) Expected power at genome-wide and suggestive significance thresholds for a sample size of n=1500. (D) Estimated power for a sample size of n=2000. In Panels C-D, the x-axis denotes the proportion of trait variance (q2) explained by a marker, and y-axis represents estimated power (in percentage). The two curves correspond to the two commonly used GWAS thresholds. In each panel, the point for 80% power is indicated with a green triangle, so that the necessary parameter configurations can be read from the graph. In panels A-B, the contour corresponding to 80% power is also marked in green.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">圖3
    圖3

    在使用全基因組基因分型數據的標準全基因組關聯研究(GWAS)設置下的估計功率(以百分比計)。(A)估計功率(以百分比表示)作為熱圖，設置顯著性閾值為5×10−8，是GWAS研究中常用的全基因組顯著性閾值。(B)顯著性閾值設為10時的估計功率−5，通常用於暗示意義的閾值。在圖a - b中，x軸表示GWAS中樣本量的範圍(n)， y軸表示性狀方差的比例(q)2)由記號筆解釋。在特定(n, q)處檢測標記的能力2)組合由顏色漸變表示。在10%的間隔功率的等高線也顯示。圖C-D顯示了本研究預期樣本量的功率曲線。(C)當樣本量為n=1500時，全基因組預期功率和暗示性顯著性閾值。(D)樣本量n=2000時的估計功率。在圖C-D中，x軸表示性狀方差的比例(q2)， y軸表示估計功率(以百分比表示)。這兩條曲線對應於兩個常用的GWAS閾值。在每個麵板中，80%功率的點用綠色三角形表示，以便可以從圖中讀取必要的參數配置。在麵板A-B中，80%功率對應的輪廓也用綠色標記。

    圖3一在使用全基因組基因分型數據和p值顯著性閾值5×10的標準GWAS設置下，以熱圖形式顯示估計功率(以百分比表示)−8。樣本量(n)在100 ~ 5000之間變化，而被標記解釋的性狀方差比例(q2(以百分比計)從0.01%到6%不等。隨著樣本量的增加，性狀方差值的範圍迅速增加，達到100%。

    圖3 b顯示在相同設置下的估計功率(以百分比表示)，但p值顯著性閾值為10−5。正如預期的那樣，對於這個不太嚴格的閾值，在相似的樣本和效應大小下，功率更高。

    簡化的功率估計如功率曲線所示圖3 c, D為本研究的預期樣本量。圖3 c顯示了在全基因組範圍內的預期功率和在不同效應量下n=1500樣本量的暗示性顯著性閾值，而圖3 d顯示樣本量n=2000時的估計功率。

    性狀方差的範圍取自Doehring等，44它提供了由幾個實驗性疼痛表型和多個標記的SNP解釋的性狀變異比例的估計。取值範圍為0.02% ~ 6%。有些性狀與本文所研究的性狀相同，而另一些性狀則不同。然而，兩組性狀的性狀方差分布非常相似，如圖4一。

    (A) Distributions of trait variance explained by a single marker from Doehring et al44 for traits included in our study and those not included. (B) Allele frequency distributions of loci associated with experimental pain in previously published cohorts, for Europeans and Colombians.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">圖4
    圖4

    (A) Doehring單標記解釋的性狀方差分布等44包括我們研究中的特征和沒有包括的特征。(B)先前發表的歐洲和哥倫比亞人群中與實驗性疼痛相關的基因座的等位基因頻率分布。

    GWAS的功率取決於snp的等位基因頻率，通過它們對檢驗統計量的影響。雖然大多數GWAS研究都是在歐洲人身上進行的，包括用於確定樣本大小的實驗性疼痛研究，44我們的研究對象是拉丁美洲混血兒。因此，我們想評估歐洲人和哥倫比亞人在各種研究中研究的實驗性疼痛或與實驗性疼痛相關的snp的等位基因頻率分布。44 45從1000基因組計劃數據庫中獲得了所有這些報告的snp的次要等位基因頻率17為西歐人(來自英國(GBR)，來自北歐和西歐(CEU)，西班牙(IBS)和意大利托斯卡納(TSI)的猶他州居民)和哥倫比亞人(來自哥倫比亞麥德林(CLM)，本研究將在那裏進行)。歐洲人和哥倫比亞人的等位基因頻率分布見圖4 b。這兩種分布非常相似，哥倫比亞分布稍微分散一些。這在一定程度上是意料之中的，因為哥倫比亞人平均有60%的歐洲(西班牙)血統。26在GWAS中，良好的等位基因頻率分布很重要，因為對於給定的樣本和效應大小，低頻等位基因的功率較低。46在這裏，與歐洲等位基因頻率分布的比較表明，當前哥倫比亞隊列將與任何歐洲隊列具有幾乎相等的權力。然而，與僅歐洲人的隊列相比，我們的隊列將具有優勢，即在其他大陸人群(如撒哈拉以南非洲人或美洲原住民)中存在的等位基因在歐洲人中不存在，也可以在GWAS中檢測到，並且可以在特定種族的複製隊列中進行隨訪。

    CANDELA項目包括來自Medellin的約2000名患者的基因型。我們預計將接觸50%-75%的參與者並對其進行表型分析，同時再接觸500名參與者，使初始樣本達到1500-2000人。

    數據分析計劃

    清理後的基因數據將首先與世界範圍內的參考樣本合並，例如千人基因組計劃，17西蒙斯基因組多樣性計劃，47愛沙尼亞生物中心人類基因組多樣性小組，48以及其他與拉丁美洲人口特別相關的歐洲和美洲原住民樣本。49合並後的數據集將通過遺傳pc和大陸祖先比例(使用監督混合)檢查遺傳異常值50)，以及意想不到的基因相似性。這些步驟通常可以檢測到任何樣本錯位或汙染，這可能反映在性別不匹配，意外的遺傳相似性或誇大的雜合率。40 51遺傳祖先估計將與自我報告的祖先信息進行比較補充附錄1)，特別是對於遺傳異常值或顯示意外結果的樣本。參與者自我報告的種族在哥倫比亞人中很少，比如東亞或南亞，也會被排除在異常值之外。作者在進行混合人群的關聯分析方麵有豐富的經驗，包括一些關於廣泛表型的GWAS出版物，其中包含如何進行此類分析的詳細協議。27 39 52 53進一步詳細說明目前使用的CANDELA樣品質量控製方案53都在網上提供補充附錄2。

    遺傳數據允許估計任何數量性狀的狹義遺傳力，這是性狀變異的部分，由遺傳數據解釋。使用GCTA軟件獲得的遺傳率估計，54將提供一個想法，哪些性狀有更多的生物學基礎，哪些是環境決定的，從而哪些性狀更適合遺傳分析，以發現相關的遺傳變異。但請注意，用這種方法相對精確地估計遺傳力(低標準差)需要幾千個樣本，52因此，目前提出的樣本量可能不足以準確估計遺傳力。

    為了更好地識別相關基因座，基因型數據將使用1000個基因組第三階段輸入參考麵板輸入到大約1000萬個基因座52利用SHAPEIT2進行第一次單倍型相位55然後使用Impute2進行推算。56輸入基因型的質量控製將使用輸入質量評分、一致性指標和高概率呼叫比例的推薦閾值進行。目前使用的CANDELA樣品插補方案的詳細信息52都在網上提供補充附錄2。

    GWAS研究將在Plink2中進行57在加性多元線性回歸模型中，對整個基因組中的每個性狀單獨進行單位點關聯研究。42協變量將在回歸中用於調整性狀變異性的任何其他來源，例如年齡、性別和BMI等基本變量，遺傳pc將用於控製種群亞結構。52 58

    回歸中包含的遺傳pc的數量取決於樣本組成，例如祖先的變化和遺傳異常值的存在/不存在。它將通過檢查每個PC解釋的方差比例(顯示在屏幕圖上)和檢查PC散點圖來確定。

    焦慮和抑鬱評分除了可作為排除標準外，還可作為GWAS的協變量。要使用的協變量的確切集合將根據初始診斷分析(如相關分析)確定。

    這些以p值表示的單位點關聯結果將通過曼哈頓圖可視化。選擇關聯基因座的常用p值閾值是5×10−8對於全基因組意義和10−5為了暗示意義。42

    這種加性多元線性回歸模型的擴展，仍然在單性狀單位點設置中，稱為混合線性模型分析，它可以更好地控製任何隱性親緣關係或群體子結構，也將在GCTA中進行。54

    單性狀單位點關聯研究有幾個擴展，增加了檢測相關位點的能力:結合幾個可能具有共同生物學基礎的相關性狀，使用MultiPhen中實施的多變量Wald測試59;或者基於基因的測試，將基因中所有位點的信號結合起來，以增加信號強度並減少多次測試的負擔，例如Plink2中實現的基於集的模型57或在GCTA中實現的fastBAT。60樣品的混合性質可用於通過混合映射方法檢測關聯。61盡管這種方法在檢測相關變異方麵的成功潛力取決於該變異的等位基因頻率在各大洲的分層程度。這些分析可能有助於檢測在經典GWAS中由於較小的效應量而動力不足的其他基因座。

    丟失數據的處理

    即使前100個樣本的完整性表明缺失率很低，也可能無法記錄某些個體的某些特征。在傳統的GWAS分析中使用的單性狀方法會自動將那些在該性狀上缺失值的個體排除在該性狀的分析之外。這同樣適用於任何特定SNP缺失基因型的個體。然而，在CANDELA隊列中使用Illumina HumanOmniExpress芯片的基因分型成功率非常高(約99.8%)，因此在任何分析中被排除的個體數量總體上都非常低。

    一些多變量分析，如pc，當應用於一組表型時，需要對個體的所有表型進行記錄值。不使用記錄了完整表型的個體子集，這會導致樣本量的一些損失，每個個體缺失的表型數據將按照R包“小鼠”中實施的標準統計程序進行估算。62當缺失數據的比例較小時，在這種多變量分析中，代入比樣本排除更可取，並且通常應用於遺傳數據，例如計算遺傳pc。58

    討論

    該GWAS包括一個定義良好的健康參與者隊列，將為naïve和敏感狀態下實驗疼痛敏感性的遺傳方麵提供重要見解。這可能允許進一步探索潛在的疼痛敏感性的生物學機製。未來的研究需要將這些發現推斷到患有慢性疼痛的患者群體中。

    病人及公眾參與

    本研究未涉及患者。

    道德與傳播

    研究結果將通過國際會議(如兩年一次的國際疼痛研究協會世界大會)上的論文和報告傳播給專員、臨床醫生和服務用戶。我們還將把我們的發現發布到painnetworks.org數據庫中。

    致謝

    我們感謝Peter Kamerman對部分研究設計的投入，以及Macarena Fuentes-Guajardo對圖2中表型照片的幫助。

    我們要感謝CANDELA團隊在組織、招聘、數據收集、樣本處理和基因分型方麵的貢獻:阿爾瓦羅·阿爾瓦拉多，安娜·卡羅萊納·奧羅斯科，Caio C. Silva de Cerqueira, Claudia Jaramillo, David Balding, Diana Rogel Diaz, Francisco de Ávila Becerril, Francisco M. Salzano, Francisco Quispealaya, Hugo Villamil-Ramírez, Ilich Jafet Moreno, Javier Mendoza-Revilla, Javier Rosique, Jorge Gómez-Valdés, Joyce de la Piedra, Lavinia Schuler-Faccini, Mónica Ballesteros Romero, Major Eugênio Correa de Souza Junior, Malena Hurtado, María Pizarro, María Teresa Del Solar, Marcelo Zagonel de Oliveira，瑪麗-溫·伯利，Maria-Cátira博爾托裏尼，瑪莎·格拉納多斯·裏弗斯，米格爾Ángel孔特雷拉斯·西克，保拉·埃弗拉多，保拉·埃弗拉多Martínez，保拉León-Mimila，裏卡多·塞布雷科斯，裏卡多·岡斯基，羅德裏戈·巴格拉·洛薩諾，羅蘭多·岡薩雷斯-約瑟，羅西琳·帕伊姆，露絲·羅哈斯，塞繆爾·卡尼薩萊斯-金特羅斯，喬斯·費利斯貝托·梅內塞斯·卡瓦耶羅警官，Tábita胡內邁爾，瓦萊裏婭·維勒加斯，凡妮莎·格蘭賈，凡妮莎·薩拉比亞，維克多Acuña-Alonzo，弗吉尼亞·拉馬洛，溫迪·哈特，威廉·阿裏亞斯和威廉·弗洛雷斯。

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    腳注

    • ABS和KA貢獻相同。

    • 貢獻者DLB和AR-L使研究概念化。資金由DLB、ABS、GB和AR-L獲得。ABS, J-CC-D, KA和LMR-A對研究方法做出了貢獻。AR-L、KA、J-CC-D、GB、FR、CG和GP參與了本研究CANDELA方麵的設計和執行。方案初稿由ABS、DLB、KA和AR-L共同起草，所有作者都提供了重要的評價並批準了最終稿。

    • 資金導致本出版物的工作由以下資助資助:英國研究委員會牛頓基金機構聯係資助(資助號216398412)，艾克斯-馬賽大學卓越計劃- A*MIDEX(法國“投資”項目)和威康信托基金會高級科學家獎學金給DLB(參考號:095698z/11/z和202747/ z/ 16/ z)。KA獲得了惠康研究者獎WT107055AIA(授予C.D. Stern)的資助。ABS由英國國立衛生研究院(NIHR)牛津生物醫學研究中心(BRC)支持。

    • 免責聲明所表達的觀點是作者的觀點，不一定是NHS、NIHR或衛生部的觀點。

    • 相互競爭的利益沒有宣布。

    • 倫理批準本研究獲得了倫敦大學學院研究倫理委員會(3352/001)和安蒂奧基亞大學牙科學學院生物倫理委員會(CONCEPTO 01-2013)的倫理批準。

    • 出處和同行評審不是委托;外部同行評審。

    • 患者同意發表不是必需的。