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摘要
簡介肺癌是中國乃至全世界最常見的癌症，也是癌症死亡的主要原因。晚期診斷是提高生存率的主要障礙。目前肺癌的早期檢測方法存在特異性低、輻射暴露風險和過度診斷等諸多局限性。呼氣分析是肺癌早期診斷最有前途的非侵入性技術之一。本研究旨在識別肺癌中的揮發性有機化合物(VOC)生物標誌物，並構建基於呼出氣分析的肺癌預測模型。
方法與分析這項研究將在一個癌症中心招募389名肺癌患者，在兩個肺癌篩查中心招募389名健康受試者。將使用Bio-VOC呼吸采樣器和Tedlar袋子收集呼吸樣本。氣相色譜-質譜聯用固相微萃取技術將用於分析呼氣中的VOCs。選擇具有統計學意義且能夠區分肺癌患者與健康受試者的VOC生物標誌物構建肺癌預測模型。
倫理與傳播該研究於2017年4月6日獲得四川省腫瘤醫院倫理委員會批準(批準號:No。scchec - 02 - 2017 - 011)。這項研究的結果將在學術會議、同行評審期刊和新聞媒體上發表。
試用注冊號chictr -國防部- 17011134;Pre-results。
- 肺癌
- 早期診斷
- 呼出的氣息
- 揮發性有機化合物
- 生物標誌物
這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名非商業(CC BY-NC 4.0)許可證發布，該許可證允許其他人以非商業方式分發、混音、改編、在此基礎上進行構建，並以不同的條款許可其衍生作品，前提是正確引用原始作品，給予適當的榮譽，任何更改都已注明，並且使用是非商業性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/．
數據來自Altmetric.com
本研究的優勢和局限性
目的:建立基於呼出生物標誌物的肺癌早期預測模型。
本研究將選擇肺癌的呼出生物標誌物，基於迄今為止通過氣相色譜-質譜分析的來自多個中心的最大樣本量。
本研究將招募精心挑選的肺癌高危但胸部CT陰性的健康對照者。
氣相色譜-質譜聯用隻能獲得呼氣中有限數量的揮發性有機化合物(VOCs)，部分VOCs無法檢測到。
簡介
在中國，肺癌發病率和相關死亡率在過去30年裏逐年上升。1 2肺癌現在是最常見的癌症和癌症死亡的主要原因，占2010年中國所有癌症死亡人數的24.9%。1 2肺癌也是世界範圍內最常見的癌症和癌症死亡的主要原因。3.隻有16.8%的肺癌患者在確診後存活5年或更長時間，4主要是因為肺癌在最初診斷時往往分期為局部晚期或轉移性疾病。４ ５然而，I期肺癌患者的5年生存率大於60%，5個6CT篩查發現的I期肺癌患者估計10年生存率可達88%。7因此，早期發現是提高肺癌患者生存率的關鍵。
目前，肺癌早期檢測技術存在諸多局限性，急需一種簡單、可靠、無創的肺癌早期篩查技術。痰細胞學的敏感性很低。8胸部x線攝影具有放射性，假陰性結果的比率非常高，特別是在早期肺癌的檢測中。9低劑量CT篩查可降低20%的肺癌死亡率，目前推薦對高危人群使用低劑量CT篩查肺癌。10 11但低劑量CT也存在假陽性率高、診斷過度、輻射暴露風險大、費用高等缺點，限製了其在人群篩查中的應用。12日13
呼氣分析是完全無創的，有很大的潛力成為早期發現癌症的篩查和診斷方法。14日至17日以前大多數針對肺癌的研究都是在小樣本上進行的。18 19對潛在的揮發性有機化合物(VOCs)肺癌生物標誌物進行了討論和總結。15日19然而，到目前為止，肺癌還沒有統一的VOC生物標誌物，而且不同研究中使用的VOC組也不同。因此，呼氣分析仍處於臨床應用的早期階段。造成這種情況的因素有很多，比如樣本量的差異大，樣本收集方法不同，分析技術不同，數據處理方法也不同。月19 - 21日我們的小組研究了糖尿病和乳腺癌中的呼出VOC生物標誌物。22日至25日我們在呼吸樣本采集、呼出VOCs分析和數據處理方麵有豐富的經驗。此外，我們有穩定可靠的肺癌患者和健康受試者來源。在本研究中，我們旨在識別肺癌的呼出VOC生物標誌物，並建立肺癌的預測模型。我們的研究假設是，通過交叉驗證，預測模型將達到80%的敏感性和80%的特異性。在隨後的研究中，該模型將在臨床環境和基於人群的篩查中得到驗證。
方法與分析
主要中心
四川省腫瘤醫院、四川大學、南充中心醫院、成都市龍泉驛區疾病預防控製中心。肺癌患者將從四川省腫瘤醫院招募。健康受試者將從南充中心醫院和成都龍泉驛區疾病預防控製中心這兩家肺癌篩查中心招募。呼氣樣本分析將在四川大學進行。
研究日期
2017年3月1日至2020年2月28日。
設計
入選標準
肺癌患者和健康受試者的年齡都在50 - 74歲之間。肺癌患者應根據2015年世衛組織肺腫瘤分類進行原發性肺癌的病理診斷。26病理分期基於肺癌的第8版TNM(原發腫瘤，區域淋巴結，遠處轉移)分類。27所有被招募的患者在呼吸取樣前不應接受任何癌症治療。基於2014年中國“農村癌症早診斷早治療”項目，從兩家肺癌篩查中心招募的健康受試者胸部CT應為肺癌陰性。
排除標準
糖尿病、其他惡性腫瘤、活動性哮喘、嚴重肝功能障礙、終末期腎病和急性炎症的患者和對照組將被排除在外。
呼吸取樣程序
本次研究招募的每位參與者都將獲得一份解釋研究的信息傳單，並簽署一份知情同意書。在呼吸采樣之前，參與者必須禁食至少8小時，並在通風良好的單獨房間休息至少10分鍾。早上07:00 - 09:00收集呼出氣體。因此，前一天23:00開始禁食可以滿足要求。對於不接受手術的肺癌受試者，將在病理診斷後和癌症治療前進行呼吸樣本采集。對於接受手術的患者，將在手術前一天收集呼吸樣本。如果術後病理不是原發性肺癌，則將患者排除在外。
所有受試者將被要求進行一次正常的吸入，然後通過口腔進行一次正常的呼氣。取樣前不允許深吸氣，取樣時不允許鼻通氣。每個受試者將呼氣三次以完成呼吸樣本收集。使用Bio-VOC呼吸采樣器(Markes Int)收集呼出氣體。英國)。受試者輕輕地向Bio-VOC注射器呼氣，直到他們感到輕微的阻力。Bio-VOC采樣器通過使用三通閥從鼻咽和上呼吸道排出死空間空氣來收集潮末呼吸氣體。潮末呼吸氣體將通過三通閥轉移到Tedlar袋中(500ml)儲存和運輸。呼氣樣本將保存在- 40°C，直到分析(7天內)。已評估了Tedlar袋中VOCs在−40°C下的存儲穩定性(在線補充圖1)．結果表明，在−40°C的Tedlar袋中，VOCs可以在7天內保持穩定。
揮發性有機化合物的儀器分析
本研究將使用固相微萃取(SPME)技術對呼吸樣本中的VOCs進行預濃縮，然後進行氣相色譜-質譜(GC-MS)分析。二乙烯基苯/羧基/聚二甲基矽氧烷(DVB/CAR/PDMS)纖維將用於提取呼出的VOCs。樣品將使用Thermo Scientific TRACE 1300氣相色譜儀與TSQ8000三重四極質譜儀耦合進行分析。VF-624ms毛細管柱(60 m×0.25 mm×0.25µm, Agilent Technology)將用於分離VOCs。分析過程如下:首先，將−40℃保存的呼吸樣本在37℃下孵育5分鍾;然後用DVB/CAR/PDMS纖維在37℃下預濃縮VOCs 30 min，最後在氣相色譜儀前入口熱解吸。氣相色譜儀將采用分離模式和特定的SPME纖維襯墊。質譜儀將使用電子電離源(70 eV)。
端點
肺癌呼出VOC生物標誌物及肺癌預測模型的準確性。
質量保證
呼吸采樣標準化
為了盡量減少研究人員在呼吸采樣過程中造成的觀察者間和觀察者內的誤差，將指定固定數量的訓練有素的工作人員收集患者和對照組的呼吸樣本。可能導致呼吸采樣誤差和結果偏差的操作要求已在網上列出補充表1．所有參與呼吸采樣的工作人員都將接受采樣過程和要求的培訓和測試。此外，所有參與本研究的研究人員都將經曆認證過程，包括知情同意簽署、呼吸采樣、樣本儲存和運輸。
室內空氣
將在通風良好的單獨房間收集患者和對照組的呼吸樣本。環境室內空氣將與每批呼吸樣本同時采集。環境空氣被用來監測可能的VOC汙染，因為它可能被受試者吸入並成為呼出氣體的重要組成部分，導致異常結果。僅在一批樣品中出現且同時在相應的環境室內空氣中出現顯著濃度的VOCs樣品將被視為汙染並將被排除。
數據管理和監控
本研究收集的所有數據，包括人口統計學信息、臨床病理信息和GC-MS原始數據，將上傳至臨床試驗管理公共平台(http://www.medresman.org)．本研究的首席研究員將定期檢查數據質量。數據監測將由四川省腫瘤醫院倫理委員會定期進行。
統計分析及計劃
樣本量計算
收集40名肺癌患者和40名健康受試者的呼氣樣本，作為樣本量計算的初步數據進行分析。至少70%的樣品中檢測到31種VOCs。其中，乙醇、異戊二烯、丙酮、異丙醇、苯、乙苯、辛醛、壬醛、癸烷等被文獻報道為肺癌的呼出生物標誌物。基於多重比較校正的錯誤發現率(FDR)程序，顯著性水平設置為0.029。28FDR的流程如下P(左),……(n)為檢驗假設的有序p值H0= {H(1）, H……(n)｝，然後H0在以下情況下被拒絕P(我)≤ia /任意n我= 1,…,n。在這項研究中，P（18)=0.00068是拒絕H的最大的一個0,所以P= 0.05×18/31 = 0.029。最後，預計每組350名受試者將識別報告的9個生物標誌物(額外15個標誌物)，這些標誌物在肺癌患者和對照組之間可能存在顯著差異，其冪值為90%或更高。從我們之前的工作來看，10%的呼吸樣本可能由於采樣或存儲故障而無效。因此，本研究的樣本量估計為778例(700/0.9)，肺癌組為389例，對照組為389例。采用Mann-Whitney U檢驗(SPSS, IBM, V.20.0)評價31種VOCs初步數據的統計學差異。基於母體正態分布，采用G-power軟件計算樣本量。
本研究的統計分析將包括以下內容
肺癌患者和對照組之間的VOCs比較將通過Mann-Whitney U測試進行。采用主成分分析、線性判別分析或獨立成分分析等方法來降低數據集的維數。之後，將使用多變量分析(有監督的機器學習方法，如PLSDA, OPLSDA, sPLSDA)和交叉驗證(10倍或留下一個)來識別呼出的生物標誌物。受試者將被隨機分配到訓練集或測試集。通過訓練集構建呼氣生物標誌物的邏輯回歸模型，並由測試集進行訓練。然後對模型進行留一交叉驗證。構建受試者工作特征(Receiver operating characteristic, ROC)曲線，並以ROC曲線下的麵積來評價模型的診斷準確性。然後計算模型的正確分類率。年齡、性別、吸煙狀況、飲酒等潛在混雜因素的影響也將通過單變量分析進行調查。邏輯回歸將用於評估潛在因素對已識別的生物標誌物的影響。 A two-sided p value of <0.05 will be considered to indicate statistical significance. All analyses will be performed using SPSS (IBM, V.20.0) and WEKA software V.3.8.3. Data analyst will be blinded to group allocation during the data processing.
患者和公眾參與聲明
患者、健康受試者和公眾均未參與研究設計、招募和實施。我們沒有計劃將結果告知研究參與者，除非他們申請。
傳播
這項研究的結果將通過各種渠道傳播，包括在學術會議上發表，在期刊和新聞媒體上發表。
致謝
作者感謝所有參與本研究的肺癌患者、患者顧問和健康受試者。我們也非常感謝相關的工作人員
南充市中心醫院(別君)和成都市龍泉義區疾病預防控製中心(石楊，阮洪海)在招募和管理健康受試者方麵提供了很多幫助。
參考文獻
腳注
WL和WD貢獻相當。
貢獻者YD和QL參與了研究構想。QL和YD參與了資金的獲取和完整方案的審查。WL和WD參與了研究設計和方案編寫。統計分析方案涉及QS和CW。YJL參與整理呼吸采樣的操作要求。ML、SX、YLL、YZ、XP和YFL參與了協議的起草。
資金四川省科技計劃項目(批準號2017SZ0013)。
相互競爭的利益沒有宣布。
倫理批準本研究於2017年4月6日獲得四川省腫瘤醫院倫理委員會批準(批準號:No。scchec - 02 - 2017 - 011)。
出處和同行評審不是委托;外部同行評審。
患者發表同意書獲得的。