分子酶學deglycosylated人類IgA1積累和誘導炎性細胞反應大鼠腎小球

文摘

背景。以前,我們已經能夠隔離IgA1從IgA腎病(IgAN)患者,可以積聚在鼠腎小球(glomerulophilic IgA1)。“glomerulophilic IgA1的決心受到列車O高糖化的鉸鏈區建議量O量的糖基化IgA1鉸鏈區在其IgAN腎小球沉積過程中發揮作用。為了證實這一點,積累下的酶學檢測糖化IgA1鼠腎髒檢查。

方法。人類IgA1孤立從健康人Jacalin親和色譜法。Desialylated (deS IgA1)或進一步degalactosylated IgA1 (deS / deGal IgA1)分子然後準備使用神經氨酸酶和β牛乳糖。兩個或兩個五毫克IgA1注入Wistar鼠的左腎動脈。老鼠犧牲在不同的時間間隔(3、9、24 h)和灌注腎皮質的一部分被免疫熒光和光線和電子顯微鏡。

結果。不同數量的deS IgA1和deS / deGal IgA1觀察大鼠腎小球。另一方麵,未經處理的IgA1分子(本機IgA1)沒有任何明顯的積累。在大鼠注射高糖化IgA1積累多形核細胞(中性粒細胞)也被觀察到。

結論。這些結果證實,在糖基化等IgA1腎小球IgA1積累中發揮了重要作用,這是緊隨其後的是中性粒細胞的浸潤到腎小球。

介紹

IgA腎病是一種常見的疾病,其特征是主要存款的IgA1腎腎小球膜(1]。盡管IgA循環免疫複合物沉積在腎小球歸因於包含IgA抗體(2),其實際的機製尚未完全了解。

人類已知IgA1分子具有獨特的糖化鉸鏈O優先聚糖側鏈(3]。我們已經報道了asialo galactosylβ1應承擔的角色,3N量acethyl必經半乳糖胺(asialo高Galβ1 3 galnac)殘留的形成大分子IgA1由於IgA1分子的構象不穩定4,5]。IgA1-IgA1互動中發現IgAN [6)是由合成抑製IgA1鉸鏈高肽核心以及Galβ1 3 galnac [7]。指出這些觀察腎小球IgA沉積可能發生的可能性不僅由於IgA免疫複合物,而且由於非優先免疫大分子的形成IgA1引發的異常O優先糖基化IgA1鉸鏈。

我們早些時候報道說,保持酶在糖化IgA1導致非共價應承擔的自我聚合和顯著增加在體外粘附細胞外基質(ECM)的蛋白質如纖連蛋白、層粘連蛋白和IV型膠原蛋白8]。最近,我們已經能夠隔離IgA1可能積聚在鼠腎小球IgAN病人。這種“glomerulophilic IgA1”量下被發現O量糖化的鉸鏈區(9]。

因此,我們調查的參與下應承擔的糖基化IgA1分子的非免疫性腎小球IgA1積累在活的有機體內。本研究的目的是確定的積累下的酶糖化IgA1應承擔在大鼠腎髒健康的人類個體。

材料和方法

製備血清IgA1

血清IgA1純化從健康的人體,Jacalin親和色譜法(10]。大約40毫升的血清用於Jacalin瓊脂糖柱(20毫升;向量的實驗室,伯林蓋姆,CA,美國)。洗後用0.01磷酸鹽緩衝劑,pH值7.5,0.15 M氯化鈉(PBS)包含0.8葡萄糖刪除非地理綁定,Jacalin蜜二糖結合蛋白被篩選了與0.1在PBS。解決方案包含IgA1當時對PBS滲出。

正常血清的Deglycosylation IgA1

純化IgA1與神經氨酸酶(NA)保持酶的消化節細菌屬ureafaciens(1.0 U / 100μl;勃林格曼海姆GmbH)和β牛乳糖(GA)從牛睾丸(1.0 U /毫升;西格瑪化工有限公司,聖路易斯,密蘇裏州,美國)根據下列程序基於我們之前的研究(8)。健康個體的純化IgA1是凍幹,然後分成三個樣品15毫克。第一個示例中,作為控製,是溶解在3毫升0.2醋酸鈉緩衝,pH值5.0 (SAB),沒有添加任何的酶。第二個示例是溶解在SAB 5μl NA的添加刪除NeuAc IgA1。第三個示例是溶解在SAB 5μl NA和50μl GA添加到釋放NeuAc和加酶量包含IgA1樣本孵化一夜之間在37°C,然後對蒸餾水透析和凍幹。非優先處理,NA的治療和NA + GA處理IgA1應承擔的分子被命名為“本地”,“德”和“deS / deGal iga的,分別。

地理酶聯免疫吸附測定(ELISA)使用花生凝集素和野豌豆屬摘要凝集素

確定deglycosylation實際發生,綁定化驗(ELISA) deglycosylated IgA1,花生凝集素(機構)和野豌豆屬摘要(VV)凝集素進行。機構和VV凝集素是眾所周知的具體識別asialo加β1,分別3 GalNAc殘留物和終端GalNAc殘留物(11,12]。微量滴定板(Linbro / Titertec流一般公司,麥克萊恩,美國)被塗上一層人,deS和deS / deGal IgA1稀釋5μg /毫升的濃度。未經處理的網站被封鎖的PBS含有1%牛血清白蛋白(BSA,σ)。100μl過氧化物酶標記機構應承擔的凝集素(2μg / ml, Seikagaku有限公司東京、日本)和過氧化物酶標記VV凝集素(2μg /毫升,σ)放在IgA1塗層和非高塗布井在孵化1 h在室溫下然後洗。所有盤子都暴露在一種酶底物組成的0.4毫克/毫升O苯二胺鹽酸鹽(σ)和0.03% v / v的過氧化氫溶液含有磷酸氫二鈉0.1米和0.05米的一水檸檬酸。發達的顏色與微型板塊閱讀器閱讀490海裏(450年生物高Rad實驗室。在模型,裏士滿,CA,美國)。

分析IgA1自我聚合使用Sephacryl列車300列

確認IgA1自我高聚合在本機和deS / deGal IgA1是應用於Sephacryl列車300列(1.5×62厘米,法瑪西亞生物技術。烏普薩拉,瑞典)和分餾。檢查每個樣本是由測量紫外吸光度在280海裏。相對比的聚合IgA1s deS / deGal IgA1和本地IgA1峰高的估計(聚合地區共有3分/總三分的非聚合應承擔的部分)。

動物

實驗研究與女性Wistar鼠體重200 - 250 g從靜岡縣購買Jikken Doubutsu,日本靜岡縣。

人類IgA1在大鼠的腎灌注

過程用於灌注大鼠腎髒是一樣的,在我們先前的研究(9)。

左腎被中線皮膚切口,暴露在乙醚麻醉和隨後的吸入麻醉(N₂0.8升/分鍾,O₂0.8升/分鍾,Falothane 2%)。主動脈夾高於左腎動脈。左腎動脈的分支從主動脈與聚乙烯中空的管子(24 g,作秀的成分,東京,日本)。左腎被注射0.3毫升的生理鹽水去除血液灌注和確認腎髒的一部分。此後,1毫升的PBS溶液包含2或5毫克每deglycosylated IgA1樣本(本地、deS、deS / deGal)被注入一個近似0.2毫升/分鍾的流量。注射後,主動脈夾被重新建立正常的血液流動。老鼠犧牲在不同的時間間隔(3、9、24 h)和灌注腎皮質的一部分被準備免疫熒光、光和電子顯微鏡。檢查的動物數量是6個老鼠在本地組,六在deS / deGal deS和11組。

組織學檢查

腎組織與緩衝福爾馬林固定,嵌入在石蠟,4μm部分沾過碘酸希夫(PAS)。第二個部分是嵌入在10月介質(英裏實驗室。,埃爾克哈特,美國)後立即取樣,在液態氮冷凍和儲存在−80°C到使用。凍結部分被削減到2μm,固定在絕對丙酮10分鍾,然後衝洗0.01包含0.015米磷酸緩衝鹽,pH值7.4 (PBS)。部分是孵化與1/20稀釋FITC標記應承擔的山羊反人類IgA應承擔的抗體在室溫下了45分鍾。彩色部分是衝洗PBS和光學熒光顯微鏡下觀察(尼康公司,日本東京)。他們被作者分級,從0到3 (TS和決斷力)。

腎組織的第三塊固定在2%戊二醛和嵌入在環氧樹脂電子顯微鏡檢查。

結果

反應的機構和VV凝集素對酶糖化IgA1

如圖1所示 ,機構凝集素的反應與deS和deS / deGal IgA1。VV凝集素的反應隻有deS / deGal IgA1。490納米的實際水平吸光度在每個試劑如下:機構,(本地)vs(deS)vs(deS / deGal);0.007±0.004vs0.149±0.004vs0.136±0.008;VV, 0.003±0.002vs0.004±0.004vs0.028±0.007。這些結果表明,酶切除NeuAc是適當地進行deS和deS / deGal IgA1但在deS / deGal IgA1半乳糖不完全移除,因為與機構凝集素的反應。

Sephacryl量300下保持酶的糖化IgA1應承擔的柱層析法

如圖2所示 ,高分子分數(聚合IgA1)肯定增加了deS / deGal IgA1相比,本機IgA1。顯然比增加deS / deGal IgA1(原生0.20;deS / deGal, 0.45)。

IgA1積累在鼠腎小球和組織學

我們之前的研究表明,間質存款出席3 h IgA1分數,注射後,IgA沉澱24小時後消失了。因此,我們也犧牲了老鼠每隔3、9和24小時。

在3 h,如表1所示 陽性染色,觀察IgA deS IgA1和deS / deGal IgA1腎髒治療但沒有明顯的存款被發現在本機IgA1治療腎髒。9點和24小時這些存款下降在deS / deGal IgA1注入老鼠。

正樣本,IgA是積累在腎小球毛細血管腔和係膜區。免疫熒光的典型分級樣品如圖3所示 。

在大鼠注射deS和deS / deGal IgA1,組織學上發現電子顯微鏡和光學顯微鏡顯示,管腔內的沉澱物(圖4 和5 )對應於IgA沉澱在免疫熒光觀察。此外,在3 h,焦點突出滲透多形核細胞的觀察腎小球deS和deS / deGal IgA1注入大鼠(數字44 b 和5 )。電子顯微鏡,多形核細胞毛細血管腔顯示吞噬活動對沉澱(圖4 b )。定係膜存款可以在電子顯微鏡觀察(圖4 c )。沉積的嚴重性和滲透較少的老鼠接受deS IgA1比老鼠接受deS / deGal IgA1。然而,這些腎小球存款和炎性細胞的反應有所下降在deS / deGal IgA1注入老鼠在9日和24小時。

討論

在這項研究中,我們清楚地觀察到酶糖化IgA1分子在鼠腎小球沉積。免疫熒光研究和電子顯微鏡檢查顯示,deS和deS / deGal IgA1s主要積累在腎小球毛細血管腔和係膜區。此外,炎症細胞反應可以誘導大鼠腎小球高糖化IgA1自下的沉積。

在我們最近的研究中,我們能夠分離和描述glomerulophilic IgA1,可能積聚在鼠腎小球,IgAN患者(9]。位於電中性的glomerulophilic IgA1分子分數和Jacalin高親和力分數明顯特色O非糖基化的。這是兼容目前的報告,積累的IgA1觀察腎小球在保持酶的糖化IgA1。

在前麵的在體外研究中,我們表明,IgA1 desialilated由唾液酸酶聚合,並進一步degalactosylation IgA1的β量牛乳糖誘導IgA1分子ECM的粘附蛋白(8]。這些結果表明,同時引起的聚集和粘附在高糖基化的IgA1鉸鏈區,導致的腎小球沉積IgA1分子。Coppo等。(13)還指出,IgA1 ECM綁定的異常有關O糖基化等IgA1分子IgAN中觀察到。在這項研究中,我們還觀察到聚合IgA1分數的增加在des / deGal IgA1,支持以前的觀測。雖然,它將是合理的推測,自我檢測聚合IgA1腎小球沉積扮演了一個角色,實際的腎小球沉積的機製下的糖化IgA1仍不清楚。

蒙泰羅et al。(14)顯示,在一個isoelectrofocusing研究,係膜IgA是anionically起訴。在isoelectrofocusing研究中,然而,另一個小峰(未知的分數)顯示了一個相對陽離子電荷。在我們之前的研究中,“glomerulophilic”IgA1相對陽離子大分子IgA1分數。此外,眾所周知,腎小球毛細血管壁和唾液酸渣帶負電荷(15,16]。因此,在這項研究中,它可以推測,在高糖基化,尤其是唾液酸的刪除,影響IgA1分子的電荷,導致一個適當的條件IgA1分子在腎小球本地化,通過減少IgA分子之間的電動斥力和腎小球基底膜。

另一方麵,它已經被提議的綁定IgA1係膜細胞可通過特定的IgA受體介導asialoglycoprotein受體和Fcα受體等。戈麥斯還是格雷羅州et al。(17)報道,老鼠和人類係膜細胞擁有asialoglycoprotein受體特異性幾個半乳糖殘基的糖蛋白,包括人類IgA1。他們建議的情況下與degalactosylated IgA1,減少係統性間隙的IgA1 asialoglycoprotein受體可以促進他們的腎小球沉積。最近,據報道,這部小說Fcα受體表達的人類係膜細胞綁定到聚合物與高親和力IgA [18]。可能的聚合underglycosylated IgA1直接係膜細胞通過受體介導綁定。

在這項研究中,deS的積累和deS / deGal IgA1s觀察腎小球毛細血管腔和係膜區。此外,在灌注後的3 h deS和deS / deGal IgA1,焦點突出積累多形核細胞的觀察腎小球毛細血管腔。9點到24 h,腎小球存款和炎性細胞的反應在deS / deGal IgA1注入老鼠有所下降。這些研究結果似乎Davin類似報道et al。(19],觀察組織學反應誘導聚合物IgA-ConA複合物的灌注大鼠的主動脈。

Shigematsuet al。(20.)報道,在阿蒂斯列車類型腎炎引起的不可溶性和不可溶性免疫複合物的注入兔子的腎動脈,免疫沉澱和積累多形核細胞中觀察到的毛細血管腔和免疫存款也出現在腎小球膜和內皮下空間。這些存款和24小時的組織學反應減少。這種沉積模式和時間的組織學反應是這項研究的結果非常相似。腎小球的管腔內的沉積量下糖化IgA1可能解釋為不溶性的實驗模型和不可溶性免疫複合物沉積在兔子。

這種模式的本地化的存款是不同於人類的IgA腎病。IgA腎病、臨床和組織學檢查被認為接受慢慢進步,因此長期沉積的IgA的低劑量。在我們的實驗模型,另一方麵,隻有一個注入大劑量的必經糖化IgA1下執行。這可能占存款的本地化的差異我們的實驗模型和人類之間IgA腎病。

總之,我們能夠確認下保持酶的糖化IgA1堆積在大鼠腎小球和誘導炎症反應。這些結果表明,在糖基化等IgA1扮演著一個重要的角色在腎小球IgA1積累,建議類似的機製的存在腎小球沉積IgA的IgA腎病。

本研究的一部分是支持由NEDO(新能源和工業技術發展組織)和朝日化學工業。作者感謝正樹先生,女士y田中和m . Saitoh女士為他們出色的技術援助。作者也感謝電子顯微鏡實驗室中心北裏大學的成員對他們有價值的建議和協助電子顯微鏡和攝影。

引用