作為研究的一部分重症毛細支氣管炎的免疫發病機理,nonbronchoscopic支氣管肺泡灌洗樣本收集來自30個嬰兒通風與RSV毛細支氣管炎(取決於抗原檢測鼻咽吸入物)在2000年和2001年。抽樣是根據最近的歐洲呼吸學會指南執行(7)。簡單地說,一個抽吸導管通過氣管導管支氣管的分支。兩個1毫升/公斤整除的無菌生理鹽水分別被灌輸下抽吸導管。灌洗液與不斷的吸入壓力恢複到粘液陷阱。樣本被凍結在-80°C到分析。控製樣本獲得冬天的孩子在同一年齡段為noninfection-related插管和通風條件。當地的研究倫理委員會批準了這項研究,並從父母知情同意了。

檢測人類metapneumovirus基因組是由逆轉錄-聚合酶鏈擴增(rt - pcr)的矩陣(M),融合(F)和核蛋白(N)基因。RNA從標本中提取了胍/二氧化矽的方法(8),15µL添加到50-µL RT反應polyT底漆和1.25 U AMV-RT(英國貝辛斯托克,Gibco)生產的互補。每個PCR反應包含10µL cDNA 2.5 U Amplitaq黃金(應用生物係統公司、沃靈頓、英國),2.0毫米Mg Cl₂300µM deoxynucleoside三磷酸,0.4µM每個引物,並提供緩衝。M基因的擴增引物hMPV-MF1(亞美大陸煤層氣有限公司TGA ATG貓CAG CCC亞美大陸煤層氣有限公司)和hMPV-MR1 (CAC AGA CTG TGA GTT TGT CAA),放大核苷酸之間的地區212年和331年,被用來給120個基點的擴增子。PCR循環條件95°C 10分鍾緊隨其後的是45 95°C的周期為1分鍾,1分鍾58°C, 1分鍾72°C,最終擴展步驟10分鍾72°C的一個優秀(沃靈頓,英國柴郡,)2400熱循環模型。積極的樣品經PCR擴增F或N基因產物,或放大的長M基因的產物。時間越長M產品使用底漆hMPV-MR1和一個新的底漆,hMPV-MF2 (ATG插科打諢苑答CTA GTA GAC),放大該地區M基因的核苷酸1和331之間,產生了一個331 -英國石油產品。對F PCR引物hMPV-FF1 (GTG AGC TGT苑ATT GGC AG)和hMPV-FR1 (CCC檸檬酸法TTG CTT AGC TGA TA)放大核苷酸之間的地區1162年和1295年的F蛋白134 - bp PCR產物。PCR循環條件的M蛋白但退火溫度為62°C。使用N PCR引物hMPV-NF1 (GTA TTA CAG亞美大陸煤層氣有限公司TTT GTT貓TGA G)和hMPV-NR1 (GAG AAC AAC法案TGC AAA GTT GG)、核苷酸之間的放大該地區710年和1034年的N蛋白給325 bp的產品。PCR循環條件的F蛋白。在每種情況下,引物設計通過調整M, N, F基因序列的原始荷蘭隔離(93.1,93.2,93.3,94.1,94.2,99.1,99.2,和00.1)(3)定義的地區舉行了共同之處。引物沒有放大從人類RSV或禽流感肺炎病毒序列。

選擇PCR產品被克隆到一個助教克隆載體(pGEM-T Promega,南安普頓,英國漢普郡),和序列測定證實的身份病毒PCR反應檢測到的。序列從M, N, F蛋白的病毒(LIV08)存入EMBL,加入數字AJ439505, AJ439504和AJ439503分別。

之間的係統發育關係隔離檢查。人類metapneumovirus序列與CLUSTALX多個校準程序(EMBL、海德堡、德國),並分析了通過使用發展史進行了推理包(PHYLIP version 3.5 c, (j . Felenstein和華盛頓大學的)。DNA序列分析通過使用DNADIST其次是鄰居加入;100副本量進行了分析。檢測RSV的rt - pcr和N基因類型描述(9)。

M基因和至少一個其他的N, F,或長M擴增子的人類metapneumovirus被發現在支氣管鏡支氣管肺泡灌洗液體來自21個(70%)的30個嬰兒通風為RSV毛細支氣管炎(表)。四個M-gene擴增子是克隆和測序。擴增子從瓊脂糖凝膠,篩選了,淨化用凝膠淨化設備(試劑盒,西薩塞克斯郡,英國)。擴增子被克隆到pGEM-T (Promega),並與MI3引物進行測序雲雀技術(英國埃塞克斯)。在每種情況下,擴增子非常相似(1基礎不同),這些報道對人類metapneumovirus密切相關(82%到97%)(3)。的圖neighbor-joining樹表明,使用102 - bp(核苷酸208 - 309)的M基因,表明利物浦(LIV08)應變的關係來自荷蘭。RSV的rt - pcr檢測隻有24(80%)的30 nonbronchoscopic支氣管肺泡灌洗樣本,盡管RSV抗原的檢測鼻咽吸入物在發病。這些24日23可以分配一個N基因型(18 NP-4 4 NP-2 1 NP-3)。人類metapneumovirus合並感染檢測到的基因型,雖然隻有四分之一(25%)的嬰兒感染人類metapneumovirus NP-2是合並感染,而13(76%)的17 NP-4。人類metapneumovirus檢測三個嬰兒從他沒有RSV擴增子可以獲得。無論是RSV還是人類metapneumovirus擴增子在nonbronchoscopic檢測支氣管肺泡灌洗液從10控製病人通風與毛細支氣管炎無關的原因。大多數嬰兒都有RSV感染的血清學證據2歲(10除了主機等因素),但是潛在的心髒,呼吸,或遺傳因素和早產,為什麼嚴重疾病發展,有些嬰兒和輕微的疾病尚不清楚。例如,盡管87%的兒童有抗體RSV年齡18個月(11),大多數孩子隻有上呼吸道症狀,如鼻炎、咳嗽和鼻炎(12)。病人的年齡也很重要,因為下呼吸道症狀發展多達40%的嬰兒< 1年,0.5%到2%的嬰兒需要住院(12)。合並感染RSV和其他病原體被描述。在研究在北愛爾蘭(13)和印度(14),合並感染發生在1.1%(與鼻病毒)和15%(與流感和副流感病毒的病毒)的RSV急性下呼吸道感染患者,分別。然而,除了在病毒感染,可能改變宿主免疫(15),急性呼吸道感染RSV獨自沒有顯著不同於RSV所致,另一個病毒(16)。RSV和人類metapneumovirus可能有類似的季節性模式(3),所以合並感染是可能的。在目前的研究中,我們發現合並感染與人類metapneumovirus與RSV 70%的嬰兒毛細支氣管炎足夠嚴重需要住院兒科重症監護病房的通氣支持。

部分M基因的序列分析從四個檢測到人類metapneumoviruses也顯示出他們彼此密切相關的兩個荷蘭隔離。合並感染的高增長率提高的可能性,同時感染RSV和人類metapneumovirus RSV的可能是另一個決定因素疾病嚴重程度。實際上,10個研究嬰兒患有嚴重RSV細支氣管炎和其他嚴重疾病的風險因素,9(90%)合並感染人類metapneumovirus。確認合並感染的作用需要縱向研究幾個細支氣管炎季節,比較疾病嚴重程度和頻率之間的合並感染RSV的全譜的疾病。最後,這個高RSV-human metapneumovirus嚴重疾病合並感染率意味著先前的研究到RSV亞型/基因型、疾病嚴重程度、細胞因子和趨化因子表達在RSV疾病可能需要重新評估。